作者：申城胡哥

目前上市的5款 BTK抑制剂^[1]均为共价抑制剂（图1），通过共价结合的方式与BTK蛋白激酶域中的C481不可逆结合，达到抑制BTK酶活性的目的。现有的BTK抑制剂（例如依鲁替尼和阿卡替尼）在治疗BTK依赖性B细胞恶性肿瘤方面有较好的疗效。但是，长期使用这些共价型BTK抑制剂后BTK 会产生C481突变（半胱氨酸残基被丝氨酸残基取代），并对这些药物产生获得性耐药，进而出现疗效减弱。而非共价BTK抑制剂，不与C481产生共价结合，因此C481突变不会导致抑制剂的活性降低，可克服人体对共价BTK抑制剂的耐药性，此外PROTACS、药物联用或多靶点治疗也为解决耐药提供了新的思路^[2]。

图1 批准上市的BTK抑制剂

LOXO-305和礼来

12月12日，礼来和默沙东在第63届美国血液学会(ASH)年会上公布了各自口服、高选择性、非共价可逆BTK C481S抑制剂pirtobrutinib（LOXO-305）和MK-1026在恶性血液肿瘤中的疗效数据^[3]。惊艳的数据凸显BTK非共价可逆抑制剂的巨大潜力（图2）^[4]。非共价抑制剂是激酶抑制剂设计的常见方法，竞争性占据ATP与激酶结合口袋，但与激酶结合后经代谢可脱离，不会对靶蛋白造成不可逆的损害，不易形成耐药。下文将简单介绍目前进展最快的LOXO305和临床在研的BTK可逆抑制剂。

LOXO-305最初由英国一家名为Redx Pharma的公司开发，原名 RXC005，后来该项目被美国 LoxoOncology公司收购，更名为LOXO-305，并于2018年被推入临床阶段。2019 年礼来公司以约80亿美元收购了Loxo Oncology，囊括一系列抗癌靶向药，其中就包括LOXO305^[5]。

图2 Pirtobrutinib部分临床数据

图3 推测的LOXO305发现过程

专利WO2017103611披露了包含LOXO305的结构通式，根据伊布替尼的药效团模型（图3），包含三个部分，hinge region、H3口袋（疏水口袋）、共价结合区（与481位的半胱氨酸共价结合）；把伊布替尼的吡唑并嘧啶胺开环得到吡唑邻位带氨基的酰胺，氨基和酰胺通过氢键形成一个伪双环，把H3口袋中氧连接的疏水基团改为酰胺亚甲基连接的芳香环，共价结合区则改成非共价结合的CF3取代的乙基，最终优化得到LOXO305。

表1 LOXO-305高效、选择性地抑制BTK和BTK C481S激酶活性

在激酶抑制活性测试中（表1），LOXO-305对371种野生型激酶测试，其对 BTK和C481突变BTK的抑制活性（IC50值）分别为1.42和3.15 nmol/L（高于其他激酶约300倍）。在体外细胞模型（图4）中，依鲁替尼和LOXO-305对HEK293细胞中BTK的抑制活性（IC50值）分别为5.7和8.6 nmol/L。而在C481突变的HEK293细胞中，依鲁替尼对HEK293的抑制活性下降到1 μmol/L以上，LOXO-305对BTK的抑制活性仍达到8.8 nmol/L。这说明LOXO-305对BTK的抑制能力基本不受C481突变的影响^[6]。

图4 BTK体外细胞模型

表2 体外实验中LOXO-305具有低的人肝微粒体清除和高渗透性

表3 动物研究中LOXO-305的药代动力学

在禁食/未禁食交叉研究中^[7]，对8只比格犬在第1 天和第8天给予30 mpk的LOXO-305，给药后48 h采集血样。结果显示：禁食组最大血药浓度（Cmax）为18100 ng/mL，血药浓度-时间曲线下面积（AUC0~t）为162000 ng·h/ml；未禁食组Cmax为10000 ng/mL，AUC0~t为105000 ng·h·mL-1。另一项实验中，对4只未禁食的Sprague Dawley大鼠单次给予35mpk 的LOXO-305，给药后24 h内采集血样。结果显示：Cmax为7930 ng/mL，AUC0~t为82200 ng·h·mL-1。表明口服给药后大鼠和犬的血浆暴露水平较高，预计BTK和BTK C481S靶区覆盖水平较高。基于人体细胞模型的体外药物代谢动力学试验数据见表3，根据体外试验数据判断LOXO-305具有较低的人体清除率和较高的渗透性（表3）。此外，临床试验 NCT03740529公布的部分人体药物代谢动力学数据显示，患者血液中LOXO-305的暴露量随给药剂量增加呈线性增加。^[8]

可逆抑制剂有望解决耐药问题

针对C481突变的临床在研BTK可逆抑制剂包括共价和非共价两种形式，如下表所示。

表4 代表性BTK可逆抑制剂^[5]

PRN1008和SAR-444727属于可逆共价抑制剂，结构中的氰基是一大特征^[11]。这类化合物（图5A）嵌入可逆的氰基丙烯酰胺基亲电试剂，通过哌啶或吡咯烷连接到吡唑嘧啶骨架上。氰基丙烯酰胺官能团则连接着具有不同空间位阻和电子性质的烷基或杂烷基，这可以影响可逆抑制剂的residence time^[10]。图5B中的配合物(PDB代码4YHF)的晶体结构中，配体与Cys481共价结合，氨基吡咯嘧啶部分与Thr474、Glu475和Met477形成氢键。叔丁基屏蔽了Cα上的质子，防止了与Cys481的硫醚键断裂。而氰基的引入使得Cα氢的酸性增强，半胱氨酸的不可逆加成变为可逆加成。可逆共价抑制剂的亲电弹头多为氰基、酮羰基等可逆亲核加成反应受体，其与靶标共价结合的可逆性，使得可逆共价抑制剂的药代动力学特征介于不可逆共价抑制剂和非共价抑制剂之间。可逆共价抑制剂具有抑制作用时间长、有效浓度低、降低脱靶毒性的优点。

图5 (A) PRN1008、1和2的化学结构。(B) 氰基化合物1的晶体配合物的Ligplot

CGI-1746是吉利德研发的可逆非共价BTK抑制剂，结构中的叔丁基苯基占据H3口袋，其吡嗪酮母核与Met477形成2个氢键，且吡嗪酮母核酰胺结构的NH与Lys430形成氢键，不与Cys481结合，活性较高。但结构中的叔丁基与酰胺在体内易发生羟基化、水解而代谢失活，影响成药性。罗氏以吡啶酮为母核降低亲脂性，引入苯甲醇与F取代的双环内酰胺得到RN-486，活性增强6倍。Genentech以六氢苯并噻吩代替叔丁基苯基得到GDC-0834，但其分子仍存在不稳定的酰胺键，通过酰胺与吡咯关成双环占据H3口袋得到GDC-0853，活性提高至0.91 nmol/L。GDC-0853对BTK各突变型细胞株的活性与野生型相当，目前处于临床三期，体内易代谢和动力学较差仍是其隐患。

BMS的BMS-935177是一类咔唑类分子，IC50为3 nmol/L，毒性研究表明该化合物在多种动物中治疗窗较窄。后续BMS-986142的IC50提高至0.5 nmol/L，具有良好的体内安全性，但类风湿性关节炎、干燥综合征的适应症，目前在临床二期无进展。日本的Carna Biosciences公司把RN-486的吡啶酮经骨架跃迁改成嘧啶胺，后关成吲哚环并在溶剂可及区优化片段得到AS1763，目前处于临床一期，适应症为慢性淋巴细胞白血病。

图6 GDC0853和RN486的改造思路

ARQ-531（MK-1026）是默克研发的一种有效的ATP 竞争性的，可逆非共价BTK抑制剂，其IC50值为0.39 nmol·L-1，其核心吡咯并嘧啶环与Gly475和Tyr476残基的铰链主链形成双齿配位的氢键；与依鲁替尼类似，苯氧基苯基占据 ATP的疏水口袋，氯原子则位于Ala428和Lys430 侧链之间；四氢吡喃甲醇的侧链则暴露在溶液环境，有利于水分子介导的广泛氢键网络。正是由于这个空间因素的限制，ARQ-531无法接近Cys481形成共价键^[12]。

技术迭代也是创新的一种思路

目前已上市的BTK抑制剂全球销售规模超过100亿美元。其中伊布替尼2020年全球销售规模达到94.4亿美元（2021年前三季度已销售73.7亿美元），属于史诗级重磅炸弹产品。第一代不可逆 BTK抑制剂依鲁替尼目前的适应证包括 MCL、WM、CLL、移植物宿主病等^[9]。第二代不可逆BTK抑制剂阿卡替尼和泽布替尼目前临床获批的适应证仅有MCL，但它相较于依鲁替尼对BTK选择性更高，因此毒性有所降低，但是因Cys481位点突变引起的耐药性问题仍然没有解决。BTK可逆抑制剂的发现有望解决这一问题，它们不依赖481位半胱氨酸结合位点。而LOXO305和ARQ531作为代表性的BTK非共价可逆抑制剂，目前临床进展最为靠前。

靶点发现严重依赖基础科研，但不代表产业界就没有发挥空间，企业仍可以在成熟领域持续做技术方面的改进。肿瘤因其内源性和复杂性，肿瘤药一直是创新药的珠峰，没有百分之百满足的临床需求，就是未满足的临床需求。在新药开发的思路上，与其卷起来，不如钻进去。

参考文献：

1.Tiantai Zhang et al; Emerging small-molecule inhibitors of the Bruton’s tyrosine kinase

(BTK): Current development, European Journal of Medicinal Chemistry 217 (2021) 113329。

2.吴敬德等；应对BTK突变所致耐药的分子设计策略；中国医药工业杂志2021，52(8)。

3.医药魔方Info公众号；疗效惊艳！礼来、默沙东公布BTKC481S抑制剂最新数据.

4.Wojciech Jurczak etal;Pirtobrutinib, A Highly Selective, Non-covalent (Reversible) BTK Inhibitor In Previously Treated CLL/ SLL: Updated Results From The Phase1/2 BRUIN Study; 2021 ASH ANNUAL MEETING & EXPOSITION;

5.https://clinicaltrials.gov/ct2/home。

6.Loxo Oncology；LOXO-305, a highly selective and non-covalent next generation BTK inhibitor, inhibits diverse BTK C481 substitution mutations；2019 ASH Annual Meeting.

7.Loxo Oncology ; LOXO-305, a next generation non-covalent BTK inhibitor, for overcoming acquired resistance to covalent BTK inhibitors; SOHO Annual Meeting 2018.

8.曹爽等；新一代非共价酪氨酸激酶抑制剂LOXO-305；临床药物治疗杂志 2020年11月 第18卷 第11期。

9.Fancui Meng et al; Recent Advances in BTK Inhibitors for the Treatment of Inflammatory and Autoimmune Diseases;Molecules 2021, 26, 4907. https://doi.org/10.3390/molecules26164907.

10.Jack Taunton et al; Prolonged and tunable residence time using reversible covalent kinase inhibitors; Nat Chem Biol. 2015 ; 11(7): 525–531.

11.Andrea Spallarossa et al; Btk Inhibitors: A Medicinal Chemistry and Drug Delivery Perspective; Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 7641.

12.H. Yesid Estupiñán et al;BTK gatekeeper residue variation combined with cysteine 481 substitution causes super-resistance to irreversible inhibitors acalabrutinib, ibrutinib and zanubrutinib; Leukemia (2021) 35:1317–1329.

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