2024-08-20 15:35:42来源：药方舟浏览量：276
mRNA技术作为一种新型的平台技术，广泛应用于预防性疫苗、治疗性疫苗、肿瘤治疗、免疫治疗、蛋白替代、基因编辑等方向。mRNA在体外转录合成中，不仅产生所需的mRNA产物，还包括反应酶（T7 RNA 聚合酶、无机焦磷酸酶）、NTP、DNA模板、盐离子及副产物(dsRNA、截断RNA片段)等杂质，这些杂质的存在会影响mRNA的准确定量、降低蛋白翻译效率、产生免疫原性等。因此在体外转录后需要通过纯化将目标mRNA从IVT混合物中分离纯化，提高目标产物的纯度和完整性，保证产品的安全性和有效性。
常规的mRNA纯化方式主要有：氯化锂(LiCl)沉淀、磁珠纯化、硫酸铵沉淀、亲和层析纯化等，其中沉淀法、磁珠法操作相对简单快捷但体量小，因此多应用于早期研发。在工业生产中，层析纯化是最主要的纯化方法，但是需要专业的纯化设备。
原理介绍：
利用锂离子在特定的pH下能减少 RNA分子之间的同电性相斥，使得RNA分子更容易聚集并形成沉淀，形成的RNA沉淀通过离心的方式从溶液中分离出来，得到纯净的RNA样品。
操作步骤：
取反应后的IVT产物加入LiCl溶液，-20°C放置。
离心(可观察到出现白色沉淀)，弃上清。
加入预冷的70%乙醇，吹打混匀后离心(可观察到出现白色沉淀)，弃上清。重复此步骤一次。
在不干扰沉淀的情况下尽量去除残留的乙醇，然后加入RNase-free H2O或其他缓冲液溶解沉淀(建议在冰上放置让沉淀完全溶解)。
方法特点：
在工业生产中由于残留的锂盐可能具有毒性，且氯化锂沉淀法通常需要在低温条件下对RNA进行沉淀，在生产放大时导致较高的能源成本和对设备的特殊要求。
对于100-200nt 的短片段RNA及浓度较低的RNA溶液，沉淀法无法有效的对其进行沉淀。
原理介绍：
mRNA纯化的磁珠有Oligo (dT)磁珠和羧基磁珠，Oligo (dT)的磁珠是利用磁珠表面偶联的亲和配体Oligo (dT)与带Poly(A)尾的mRNA分子之间的特异性结合，通过磁力作用将目标RNA分子与其它非特异性结合的杂质分离开来。羧基磁珠是利用mRNA分子在酸性条件下带负电荷，可以与羧基磁珠表面的羧基官能团发生静电作用，从而实现RNA的纯化。mRNA越长，表面裸露出来带负电的磷酸基团越多，更容易吸附到磁珠，mRNA越短，需要增加磁珠体积来提高吸附能力。
操作步骤：
取反应后的IVT产物加入不同体积的磁珠，混匀后室温孵育。
将样品置于磁力架，溶液澄清后弃上清。
加入新鲜配置的80%乙醇，室温孵育后弃上清。重复此步骤一次。
在不干扰磁珠的情况下尽量去除残留的乙醇，然后加入RNase-free H2O混匀，室温孵育后取上清。
方法特点：
磁珠法纯化能够有效地去除蛋白、盐离子和其他杂质，从而获得高纯度的 mRNA。但是磁珠表面的疏水作用力会对mRNA完整性产生负面影响，在使用羧基磁珠时容易出现磁珠纯化受磁珠储存或者使用条件影响较大。
在使用磁珠纯化时需注意：避免磁珠冷冻和高速离心，以免对磁珠产生破环；磁珠应在使用前待其温度平衡至室温后再使用，以保证最佳的结合效率；洗涤磁珠用的乙醇-水溶液尽量现用现配或注意密封，以免乙醇挥发影响回收效率；避免磁珠过度干燥，降低洗脱效率。
硫酸铵沉淀法
原理介绍：
硫酸铵作为沉淀剂，根据目标mRNA与杂质之间的溶解度差异，选择性地沉淀mRNA，并具有高溶解度和高生物安全性。
操作步骤：
溶解在pH 7.0溶液中的mRNA加入等体积的pH 7.0中制备的4M硫酸铵溶液，20℃下孵育2h。
在20℃条件下以13000rpm离心10分钟，收集上清液和沉淀。
加入RNase-free H2O后混匀，充分溶解沉淀。
方法特点：
硫酸铵沉淀法的回收率较高，且对DNA模板和dsRNA的去除率较高。
纯化无需特殊设备，为IVT体系或后续下游工艺中快速分离mRNA提供了理想的选择。
亲 和 层 析
原理介绍：
亲和层析的主流方法是Oligo dT亲和色谱，Oligo dT 填料以聚苯乙烯为基质，表面覆盖大量羟基、官能化聚(dT)基团。高盐条件下，盐离子屏蔽同样带负电荷的填料骨架与mRNA的静电排斥作用，使得mRNA分子和Oligo dT柱配基的构象变得松弛，mRNA的poly(A) 尾与官能化聚(dT)基团碱基配对形成氢键，从而捕获 mRNA 分子，而缺乏 Ploy(A) 尾的杂质如：游离核苷酸、短链转录本、酶等则无法结合到Oligo dT柱上。当缓冲液没有盐时，dT配基主链上的磷酸根负电荷和poly (A) 主链上的磷酸根负电荷之间的静电排斥使其远超氢键作用，从而使mRNA 顺利洗脱下来，收率可高达 90% 以上。
传统的亲和层析需要专业的纯化设备，纯化工艺需要不断摸索，以满足于mRNA的工业生产。现瀚海新酶推出轻量级的亲和层析纯化试剂盒，无需专业的纯化设备仅需离心即可，在30分钟内完成样本的纯化，纯化后的mRNA可用于各种下游实验，能够在保证高质量同时快速方便的获得mRNA。
亲和层析纯化试剂盒和LiCl
纯化方法比较
（请备注验证：mRNA+姓名+公司+手机+职务）
[1] LiCl Precipitation for RNA Purification, Retrieved Jan 8, 2024.
[2] RNA Clean XP Performance and Data, Retrieved Jan 8, 2024.
[3] D Prazeres, T Schluep, C Coony, Preparative purification of supercoiled plasmid DNA using anion exchange chromatography, J Chromatogr A 806 (1998) 31–45.
[4] J Koubek, KF Lin, YR Chen, RP Cheng, JJT Huang, Strong anion-exchange fast performance liquid chromatography as a versatile tool for preparation and purification of RNA produced by in vitro transcription, RNA 19 (2013) 1449-1459.
[5] Xue Feng, Zhengjun Li, Zhiguo Su, Shiyi Che, Baiqian Dai, Yuan Cheng, Songping Zhang. Rapid and high recovery isolation of mRNA from in vitro transcription system by ammonium sulphate precipitation at room temperature. Separation and Purification Technology. Volume 336, 2024, 126331.
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