点评 | 朱冰（中科院生物物理所）、何爱彬（北京大学）转录因子（Transcription Factor, TF）通过结合基因组调控元件（如启动子和增强子），共同调控细胞命运决定、分化过程及应激响应。基因表达调控通常不是由单一TF独立完成，而是多个TF按照特定的组合规则协同作用，其结合模式受染色质可及性、核小体布局和表观修饰等因素的动态调控。系统解析多种TF的结合事件及其相互关系，对于理解基因调控的基本原理，并揭示其在发育与疾病发生中的功能机制具有重要意义。然而，受限于现有技术，传统研究多聚焦于单一TF，难以全面刻画多TF协同调控的全景图。抗体依赖的ChIP-seq和CUT&Tag等方法在通量和并行检测能力方面存在限制；ATAC-seq和DNase-seq虽可用于推断TF结合足迹（footprint），但在分辨率和单细胞适用性上仍显不足。近年来发展出的SMF、SMAC-seq和Fiber-seq等基于DNA修饰酶的策略，虽可用于单分子检测，但受限于酶的序列偏好性，且其修饰信号在扩增中难以保留，需依赖三代测序直接读取，不利于在单细胞层面的广泛应用。因此，如何在单细胞尺度高通量、准确地获取多种TF结合信息，仍是当前基因调控与表观遗传研究面临的核心技术挑战之一。为突破这些技术瓶颈，同济大学生命科学与技术学院张家民教授、高绍荣教授、史偈君教授、刘晓雨教授多个课题组团队合作，在Protein & Cell发表了文章 Genome-Wide Investigation of Transcription Factor Footprints and Dynamics Using cFOOT-seq ，共同开发了全新的 cFOOT-seq 技术。cFOOT-seq 基于高效、低序列偏好的双链 DNA 脱氨酶 SsdAtox，可在全基因组范围内以单碱基分辨率同时检测染色质开放性、核小体定位和转录因子足迹，并通过与 ATAC-seq 联合，实现单分子乃至单细胞层面上定量地分析大量转录因子的结合占位信息，显著突破了传统方法在多靶点和灵敏度上的限制。研究团队通过比较 SsdAtox、Ddd_Ss 和 Ddd_Fa 的脱氨效率、序列偏好及 5mC 脱氨活性，最终选择了表现最优的 SsdAtox。cFOOT-seq 以SsdAtox为核心，可高效将开放染色质中的胞嘧啶（C）脱氨为尿嘧啶（U），并在扩增测序后显示为胸腺嘧啶（T），从而直接记录 染色质开放性、核小体定位与 TF 足迹。凭借其高灵敏度与单碱基分辨率，cFOOT-seq 能在一次实验中同时解析上百种 TF 的占位信息，适用于开放区和非开放区，并对低起始量样本表现出卓越性能。cFOOT-seq 对染色质可及性、核小体排布和转录因子结合等多维度染色质景观信息的一体化检测能力，使得研究者能够在单次实验中全面检测调控元件周围的染色质环境与转录因子占位信息，从而更系统地解析基因调控的动态逻辑。cFOOT-seq对TF足迹的检测依赖于DNA脱氨而非DNA切割，保留了染色质DNA完整性，因此cFOOT-seq可实现与其他组学的联合应用。与ATAC-seq进行联合可形成ATAC-cFOOT-seq和cFOOT-ATAC-seq两种方案，实现更低测序成本下的开放染色质TF占位分析。ATAC-cFOOT-seq在开放区富集方面更突出，而cFOOT-ATAC-seq则具备更高检测灵敏度。基于开放区的深度测序，该技术可定量分析单分子级TF足迹及TF协同作用；结合孔板建库流程，scATAC-cFOOT-seq将其能力扩展到单细胞水平，揭示复杂细胞群中的TF动态。研究团队开发了FootTrack平台，通过FOS（Footprint Occupancy Score）和TFOS（Transcription Factor Occupancy Score）指标，实现已知结合位点上TF占位强度的精确量化，并支持重头（de novo）足迹预测，帮助发现新的TF结合模式与调控因子。利用cFOOT-seq，研究团队捕获了不同细胞类型的关键TF占位，深入解析了OSKM诱导重编程及SWI/SNF染色质重塑因子抑制/恢复过程中的TF动态变化。在 BRM014 处理的 HepG2 细胞中，对多个转录因子 TFOS 变化的分析实现了基于 SWI/SNF 依赖性的聚类。具有相似 SWI/SNF 依赖性的转录因子结合位点在基因组上呈更紧密的邻近分布，提示了染色质重塑与转录因子结合的一种能量高效空间布局。凭借高灵敏度和单分子/单细胞分辨率，cFOOT-seq为高通量地解析转录因子结合的时空动态提供了强有力的工具。未来将该技术与高通量单细胞ATAC-seq及长读长测序平台结合，并借助多组学和机器学习算法，进一步提升足迹预测的精度与广度，可以推动转录调控机制研究进入新阶段。cFOOT-seq 将为绘制高精度基因调控网络、破解转录调控奥秘提供强大助力，并为揭示发育、再生及疾病背后的分子机制奠定坚实的技术基础。同济大学生命科学与技术学院博士研究生王姮、武昂和杨孟臣为论文共同第一作者。同济大学生命科学与技术学院张家民教授、高绍荣教授、史偈君教授与刘晓雨教授为论文共同通讯作者。
在理想的教科书模型中，我们往往看到一个转录因子会靶向一个基因，激活其表达。然而，在体内复杂的基因调控复杂网络中，往往有多个转录因子共同调控一个基因的表达，并且它们之间存在协调与竞争，会受到染色质环境的影响，并呈现高度的动态性。传统的组学技术手段难以在单次实验中同步获取多种转录因子在单条DNA上的结合信息及其所处的染色质环境，限制了我们对基因调控机制底层逻辑的深入理解。同济大学张家民、高绍荣、史偈君和刘晓雨等课题组合作开发出一种基于双链DNA脱氨酶的转录因子足迹检测技术——cFOOT-seq，这一技术与谢晓亮课题组发表的FOODIE技术异曲同工，为破解这一难题提供了新思路。该方法利用双链DNA脱氨酶 SsdAtox，以单碱基分辨率将染色质可及性、核小体排布及TF结合足迹同时“写入”DNA序列。相比传统依赖抗体或酶切的方法，cFOOT-seq在通量、分辨率与灵敏度上实现了突破，可在一次实验中检测上百种TF的结合信息。FootTrack分析平台通过FOS和TFOS指标实现TF结合强度的定量评估，并支持TF协同作用及其与染色质状态的关联分析。结合motif信息，该平台还能实现de novo的TF占位预测，并追踪其动态变化。该技术在细胞重编程与染色质重塑等模型中展现出了良好的动态检测能力。cFOOT-seq不破坏DNA完整性，具有良好兼容性。与ATAC-seq联用后，可在更低测序深度下在单分子、单细胞分辨率，实现更精准的 TF 占位定量和协同作用分析。cFOOT-seq技术将染色质可及性、核小体定位与TF结合统一于同一测序框架，构建出全面、高精度的染色质景观图谱。这一多维协同检测能力，为解析转录因子的动态行为及其与染色质环境的相互作用、揭示基因调控“语法”和构建精准调控网络提供了坚实的技术基础，具有广阔的应用前景。基因表达调控是细胞命运决定、发育程序执行及应激应答的核心机制，而转录因子（TF）对特定顺式元件的识别与结合是关键环节。在真实细胞环境中，TF常以协同方式发挥作用，其占位模式受到染色质可及性、核小体布局与表观修饰等多重因素的动态调控。然而，受限于现有技术，我们长期只能聚焦特定TF的结合状态，难以全面解析多个TF协同调控的动态图谱。如何在全基因组尺度、以单分子甚至单细胞的精度，捕捉数百种转录因子的占位信息，是表观遗传与基因调控领域长期未解的重要难题。同济大学张家民、高绍荣、史偈君和刘晓雨等课题组团队合作开发的cFOOT-seq技术为这一挑战提供了创新解决方案。该研究开发了cFOOT-seq，一种基于双链DNA胞嘧啶脱氨酶 SsdAtox 的染色质足迹检测技术，实现了在基因组范围内对转录因子占据位点、核小体定位和染色质可及性的同步解析。与传统ChIP-seq或ATAC-seq等方法相比，cFOOT-seq具备无需抗体、无需切割DNA、能在开放与闭合染色质中均可检测TF占据的显著优势，尤其适用于低细胞数、单分子乃至单细胞分辨率的研究。1. 全新酶学机制与定量逻辑：通过胞嘧啶脱氨酶将开放染色质中的胞嘧啶转化为尿嘧啶，以序列转换为媒介记录染色质结构信息；2. FootTrack 分析框架：配套开发的算法平台能从已知或de novo预测的motif出发，定量追踪TF占据动态；3. 单分子与单细胞解析能力：结合ATAC-seq进行开放染色质富集，cFOOT-seq在单分子和单细胞层面成功解析TF足迹和共占据事件；
- 全面刻画TF对SWI/SNF染色质重塑复合物的依赖性；
- 揭示具有相似SWI/SNF依赖性的TF在染色质上的空间组织规律。
综上，该研究不仅提出了一种创新性强、适配性高的转录因子组学工具，也在转录调控网络、细胞命运转变机制和染色质重塑依赖性等多个维度提供了新的观察窗口，将对表观基因组学与功能基因调控研究产生深远影响。
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