2025-05-29 11:52:35来源：药方舟浏览量：117
引言部分（适用范围、环境要求等）：
2020版： “本法系用于在有氧条件下测定非无菌产品中可存活微生物（细菌总数和真菌总数）的数量。本法不适用于活菌制剂的计数，除非另有规定。微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。洁净空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。”
2025版： “微生物计数法系用于在有氧条件下生长嗜温细菌和 真菌的计数。本法适用于检查非无菌制剂及原、辅料等是否符合规定的 微生物限度标准时，应按以下规定进行检验，包括供试品的 取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不适用于活菌 制剂的检查。微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。检 验全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污 染的措施不得影响供试品中微生物的检出。洁净空气区域、 工作台面及环境应定期进行监测。”
差异分析： 2025版在第一句话的表述上更为具体，将“可存活微生物（细菌总数和真菌总数）的数量”细化为“嗜温细菌和 真菌的计数”，并在第二句话增加了“本法适用于检查非无菌制剂及原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按以下规定进行检验，包括供试品的 取样量和结果的判断等”的说明。其他关于不适用范围、环境要求、无菌操作、防止污染的描述完全一致。这些变化是对适用范围和目的的进一步明确和补充，并未改变方法的原理和核心要求。
判断： 非实质性变化
[A2]
方法适用范围和基本要求： 对比结果显示，两个版本在方法适用范围（嗜温细菌和真菌计数）、不适用范围（活菌制剂，除非另有规定）、试验环境要求、无菌操作、防止污染的措施不影响检出、洁净区域监控等方面的描述完全一致。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
供试品抗菌活性去除或中和： 对比结果显示，两个版本均要求尽可能去除或中和供试品抗菌活性，并强调需确认中和剂或灭活剂的有效性和对微生物无毒性。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
表面活性剂的使用： 对比结果显示，两个版本均要求确认供试液制备中使用的表面活性剂对微生物无毒性以及与中和剂或灭活剂的相容性。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
计数方法： 对比结果显示，两个版本均列出了平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（MPN法）三种计数方法，并说明了MPN法的特点和适用性。均强调应根据供试品特性和标准选择方法，并需确认适用性。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
培养基适用性检查和计数方法适用性试验： 对比结果显示，两个版本均要求进行计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验，以确认方法适用于该产品。均要求在检验程序或产品变化时重新进行适用性试验。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
菌种及菌液制备： 对比结果显示，两个版本对试验用菌株传代次数（不超过5代）和保存技术的要求一致。对菌液制备后不同保存条件（室温2小时内，2-8℃ 24小时内）下的使用时限规定一致。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
阴性对照（适用性试验部分）： 对比结果显示，两个版本均要求进行阴性对照试验以确认试验条件，要求无菌生长，并规定有菌生长时应进行偏差调查。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
培养基适用性检查方法（1105计数）： 对比结果显示，两个版本均要求对商品化预制、脱水或配制培养基进行适用性检查。规定了接种量（不大于100cfu）、使用的培养基种类（TSB液体、TSA、SDA平板）、平行数量（2管或2平板），与对照培养基对比，以及固体培养基菌落数比值（0.5-2范围内且形态一致）和液体培养基生长良好作为判定标准。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
计数方法适用性试验 – 供试液制备： 对比结果显示，两个版本均规定根据供试品理化和生物学特性选择适宜方法制备供试液，加热温度不超45℃，制备到接种不超1小时。列举了水溶性、水不溶性非油脂类、油脂类、膜剂、肠溶及结肠溶制剂、气雾剂、贴剂/贴膏剂等不同剂型的常用制备方法。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
计数方法适用性试验 – 接种和稀释： 对比结果显示，两个版本均要求按表1规定和要求进行接种和稀释，加入菌液体积不超供试液体积1%，优先选择最低稀释级。规定了试验组、供试品对照组、菌液对照组的设置和操作。对抗菌活性或溶解性差供试品进一步处理的要求也一致。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
计数方法适用性试验 – 抗菌活性的去除或灭活： 对比结果显示，两个版本判断抑菌活性的标准一致（试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值小于菌液对照组菌落数值的50%）。列出的四种消除抑菌活性的方法一致（增加稀释液/培养基体积、加中和剂/灭活剂、薄膜过滤、联合使用）。对使用中和剂/灭活剂的要求和对照组判定标准（0.5-2范围）一致。对无法消除抑菌活性的处理原则也一致。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
计数方法适用性试验 – 供试品中微生物的回收： 对比结果显示，两个版本均要求对表1试验菌逐一进行回收试验，可采用平皿法、薄膜过滤法或MPN法。
平皿法（倾注法和涂布法）： 对比结果显示，倾注法的具体操作步骤（供试液体积、培养基用量、混匀、凝固、培养）和要求一致。涂布法的操作步骤（培养基用量、制板、表面干燥、接种量、培养）和要求一致。两者都要求每株试验菌每种培养基至少制备2个平皿，并测定对照组菌数计算平均值。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
薄膜过滤法： 对比结果显示，对滤膜孔径（不大于0.45μm）、直径（一般50mm）、冲洗量调整、材质影响、滤器滤膜灭菌和完整性、不同类型供试品过滤前处理、冲洗液用量和总量限制（每次100ml，总不超500ml，最多不超1000ml）、过滤后滤膜转移到相应培养基的要求（需氧菌用TSA，霉菌酵母用SDA）、培养和计数方法（同平皿法）、每张滤膜菌落数上限（不超100cfu）、每株试验菌每种培养基至少一张滤膜、测定对照组菌数等要求和操作描述完全一致。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
MPN法： 对比结果显示，两个版本关于MPN法的适用范围、操作步骤（连续稀释级数至少3个，每级3份1ml接种TSB液体培养基）、对照组测定、必要时加入成分、培养条件（30-35℃不超过3天，逐日观察）、结果难以判断时的转种方法、根据生长管数查表3最可能数等描述完全一致。表3（最可能数）内容也一致。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
计数方法适用性试验 – 结果判断： 对比结果显示，两个版本对平皿法或薄膜过滤法适用性判定标准（试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值在0.5-2范围内）和MPN法判定标准（试验组菌数在菌液对照组菌数的95%置信限内）一致。对回收试验合格后进行供试品检查的规定一致。对回收不达要求时选择回收最接近要求的方法和试验条件进行检查的原则也一致。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
供试品检查 – 检验量： 对比结果显示，两个版本对检验量的定义一致。一般检验量（10g或10ml，膜剂/贴剂100cm²）和抽样数量（不少于2个最小包装，大蜜丸不少于4丸，膜剂/贴剂不少于4片）的规定一致。对贵重药品、微量包装、活性物质含量低的制剂以及样品量有限或批产量极小的活性物质等特殊情况的检验量规定，对比发现2025版截图覆盖的内容与2020版文字完全一致。分析判断： 在对比范围内，本部分内容一致，无实质性变化。
供试品检查 – 供试品的检查方法： 对比结果显示，两个版本均规定按适用性试验确认的方法测定需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数。指明了测定不同总数使用的培养基（需氧菌用TSA/TSB，霉菌酵母用SDA）。要求进行阴性对照试验，要求无菌生长，如有菌生长需调查偏差。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
供试品检查 – 平皿法（培养和计数，菌数报告规则）：
[A1]总则 (制备供试液和接种)完全一致。培养和计数完全一致。菌数报告规则在对选取稀释级菌落数范围的推荐值上存在差异：
其他关于报告依据、计算方法（取最高平均菌落数，计算每g/ml/cm³的微生物数，取两位有效数字）以及对低菌数和无菌的报告方式的描述在两个版本中是完全一致的。
分析判断：
在供试品检查的平皿法中，两个版本在制备供试液和接种、培养和计数（包括培养条件、计数要求、菌落蔓延处理和双平板差异判定）等核心操作步骤和要求上是完全一致的。唯一的区别在于“菌数报告规则”中对于推荐选取用于计数的稀释级平板的菌落数范围。2025版将推荐的上限从300cfu（需氧菌）和100cfu（霉菌酵母）分别调整到了250cfu和50cfu。
这一调整是为了更精确地计数。当平板上的菌落过多时，菌落之间容易重叠，导致计数结果偏低（即发生菌落蔓延或计数困难）。通过降低推荐计数的菌落数上限，可以更好地避免这类问题，从而提高计数结果的准确性。
需要注意的是，两个版本都使用了“宜选取”这个词，表明这是一种推荐的最佳实践，而非强制要求。在没有符合推荐范围的平板可计数时，仍然需要根据其他规定（如菌落蔓延不能计数，双平板差异等）选择合适的稀释级进行计数和报告。
因此，将推荐的计数范围收窄，是基于微生物计数准确性考虑的一种方法优化和完善，它并没有改变平皿计数的原理、基本操作步骤、计算方法或最终结果的表达形式。实验室需要调整选取计数平板时的偏好，但不需要改变核心的检验技能、设备或数据处理方式（除了选取数据）。
基于对药典原文的对比和对检验方法的理解，在供试品检查的平皿法中，修改推荐的计数范围是一个非实质性变化。[A1]
供试品检查 – 薄膜过滤法（制备、培养计数、报告）：
[A4]
2020年版文字： 在1105通则“供试品检查 – 薄膜过滤法”的“培养和计数”小节中，详细规定了培养条件和计数方法同平皿法，并明确指出“每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。” 以及菌数报告规则（无菌时的报告方式）。
2025年版： 在2025年版该部分的描述中，规定了培养条件和计数方法同平皿法。但是，文字中省略了“每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。”这一明确的限制性规定。其他关于供试液制备、取样量、过滤、冲洗、滤膜转移等前续步骤在两个版本中是基本一致的。
差异分析：
尽管2025版仍然要求计数方法同平皿法，但平皿法的计数原则（如推荐计数范围）并不能完全替代薄膜过滤法针对膜表面计数的特定要求。移除这一明确上限，可能导致计数结果的主观性增加和准确性风险提高。对薄膜过滤法的计数执行和结果可靠性有显著影响，构成实质性变化。
理论上，某些微生物或在特定基质中，即使菌落数超过100cfu，如果菌落形态清晰且分布均匀，实验室可能有能力进行相对准确的计数。移除硬性上限，允许实验室根据自身验证数据和风险评估来确定更适合其产品和方法的计数范围。此变化可能希望实验室将平皿法中的计数原则（如选择合适的稀释级进行计数，避免计数困难的平板等）更普遍地应用于薄膜过滤法，而不局限于一个数值。这一变化可能导致计数结果的主观性和变异性增加，对实验室的质量控制体系、方法验证和SOP管理提出了更高的要求。
[A4]
供试品检查 – MPN法： 对比结果显示，两个版本对MPN法供试液制备、接种、培养条件（30-35℃ 3-5天）、确认生长方法、记录生长管数、从表3查最可能数等描述完全一致。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
结果判断（1105总则）： 对比结果显示，两个版本对需氧菌总数和霉菌酵母总数的定义（包含异类微生物菌落）、沙氏葡萄糖琼脂上细菌影响计数时的处理方法（使用含抗生素或其他选择性培养基）和选择性培养基适用性检查要求、MPN法测定结果、微生物限度标准的解释（10¹cfu为20，10²cfu为200等）、合格判定的标准（总数均符合规定）等描述完全一致。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
稀释液、冲洗液及培养基（1105引用）： 对比结果显示，两个版本均指明参见通则1106的相关规定。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
方法适用范围和基本要求： 对比结果显示，两个版本对控制菌检查法用于检查特定微生物、适用于非无菌制剂及其原辅料、对检出控制菌或其他致病菌按一次结果为准不再复试的规定一致（尽管2025版截图未完全覆盖此句，但基本原则未变）。供试液制备及实验环境要求同1105的引用也一致。抗菌活性去除/中和和表面活性剂使用的注意事项也与1105中的要求一致。分析判断： 本部分内容基本一致，无实质性变化。
培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验： 对比结果显示，两个版本均要求进行培养基适用性检查和方法适用性试验，并在程序或产品变化时重做。对培养基适用性检查的项目（促生长、抑制、指示特性）、具体检查方法（液体/固体培养基促生长、抑制、指示特性）和判定标准，以及所用菌株参见表1的要求完全一致。对方法适用性试验的供试液制备引用、试验菌选择（包括耐胆盐革兰阴性菌的试验菌）、具体操作步骤（直接接种或薄膜过滤加菌）、培养条件和判定标准（能检出相应反应特征）也完全一致。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
菌种及菌液制备： 对比结果显示，两个版本对试验用菌株传代次数（不超过5代）和保存技术的要求一致，列出的控制菌试验菌种清单（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、白色念珠菌、生孢梭菌）一致。菌液制备方法（不同菌种的培养条件、稀释液制备）和菌液保存时间/条件（室温2小时内，2-8℃ 24小时内，生孢梭菌孢子悬液2-8℃验证期内）也完全一致。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
阴性对照（1106总则）： 对比结果显示，两个版本要求进行阴性对照试验以确认试验条件，应无菌生长，如有菌生长需调查偏差。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
控制菌检查方法适用性试验 – 结果判断： 对比结果显示，两个版本关于适用性试验结果判断的原则一致，检出试验菌则按此方法进行检查，未检出需消除抑菌活性后重试，抑菌无法消除时选择抑菌消除相对彻底的方法进行检查。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
供试品检查： 对比结果显示，两个版本均规定按适用性试验确认的方法进行检查。阳性对照试验（方法同供试品检查，加菌量不超100cfu，应检出）和阴性对照试验（稀释剂代替供试液，应无菌生长，有菌需调查）的要求、操作和判定标准完全一致。
[A3] 在2025年版中，在原有的上述描述之前，新增了一段重要的表述：“实验室应基于质量风险管理的要求，根据产品特性、方法适用性试验结果、人员技能与经验、数据可靠性、污染控制措施和实验室质量控制水平等因 素，综合评估确定日常检验过程中阳性对照试验的必要 性、频次及其他要求。”这段新增的文字明确要求实验室在进行日常控制菌检验时，需要基于质量风险管理的原则，综合考虑多种因素（产品特性、方法验证结果、人员经验、数据可靠性、污染控制措施、实验室质量控制水平等），来评估确定阳性对照试验的必要性、频次以及其他要求。而2020年版仅规定了阳性对照试验的操作方法和结果要求，没有提及风险管理和频率确定的原则。
分析判断： 这是一处实质性变化：
改变了质量控制策略的导向：
引入了风险管理原则：
赋予实验室确定频率的灵活性：
2025年版药典明确了在日常控制菌检查中，需要考虑阳性对照的风险性（以及其他因素），并通过风险评估来确定其执行的频率，而不再是简单地规定必须每次都做（或者不规定频率，由实验室自行摸索）。
此变化是否对具体的某个产品的测试方法造成了实质性影响的分析：
“实质性影响”通常指的是对检验方法的原理、核心操作、关键参数或结果判断的准确性/可靠性产生显著改变。例如，如果药典要求从平皿法改成更灵敏的PCR法，这就是实质性影响；如果要求培养温度从30-35℃改成20-25℃，这也可能影响特定菌的生长，是实质性影响。而2025年版新增的阳性对照要求，是关于围绕核心检测步骤的质量控制策略的改变。它影响的是何时执行一个辅助性的质量控制检查（阳性对照），而不是改变执行主要的样品分析步骤本身。阳性对照的目的是验证方法在样品基质中的回收能力，确保主要检测结果的可靠性，但它本身不是产生样品主要检测结果（如总菌数是多少）的步骤。
因此，2025年版通则1106在“供试品检查 – 阳性对照试验”中新增的关于基于风险管理确定日常阳性对照频率的要求，是对实验室质量管理体系和日常检验质量控制策略的实质性影响和要求的提高。从具体产品检验方法的文件和管理层面看，需要更新文件，可能是实质性工作量的增加。从具体产品检验方法的核心分析步骤层面看，该要求本身不直接改变样品如何被处理和检测以获得主要结果，不构成对核心分析步骤的实质性影响。
即使核心检验方法（如1105和1106的基本原理和操作步骤）在2025版中没有发生实质性变化，但作为依据新版药典提供检验服务的第三方实验室，需要证明其所使用的方法是符合并适用于2025年版药典要求的。这通常意味着需要对所检测的每种产品类型（或代表性产品）进行方法适用性验证（如果之前未做过）或再验证（如果之前是依据2020版验证的）。这个验证过程需要依据2025年版通则1105和1106的要求进行，包括进行阳性对照试验以确认方法在特定产品基质中的回收能力。虽然核心技术本身变化不大，但药典版本的更新是官方标准的变更，实验室需要证明其能力符合当前标准。特别是2025版1106中明确要求日常阳性对照频率基于风险管理确定，这也要求实验室在更新到2025版时，需要在方法验证或再验证的基础上，建立并执行这个风险评估过程，来确定今后日常检验中阳性对照的执行策略。[A3]
耐胆盐革兰阴性菌检查： 对比结果显示，供试液制备和预培养（稀释剂、比例、培养温度时间）、定性试验（增菌培养基、培养条件、划线培养基、培养条件、无菌落判未检出）、定量试验（取样量、增菌培养基、培养条件、划线培养基、培养条件）、结果判断（根据平板生长判断培养管阳性阴性，查表2最可能菌数）等所有步骤、条件和判断标准完全一致。表2（MPN法最可能数）内容也一致。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
大肠埃希菌检查： 对比结果显示，供试液制备和增菌培养（供试液制备引用、取样量、增菌培养基、培养条件）、选择和分离培养（增菌培养物转移、选择培养基、培养温度、选择琼脂平板、培养条件）、结果判断（平板生长需鉴定确证，无生长或鉴定阴性判未检出）等所有步骤、条件和判断标准完全一致。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
沙门菌检查： 对比结果显示，供试液制备和增菌培养（取样量、增菌培养基、培养条件）、选择和分离培养（增菌培养物转移、选择培养基、培养条件、分离培养基、培养条件、沙门菌在分离培养基上的菌落特征、疑似菌鉴定方法如三糖铁琼脂）等所有步骤、条件和描述完全一致。结果判断（根据分离培养和平板/三糖铁琼脂反应判断是否需鉴定或判未检出）也完全一致。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
铜绿假单胞菌检查： 对比结果显示，供试液制备和增菌培养（引用1105、取样量、增菌培养基、培养条件）、选择和分离培养（划线培养基、培养条件、菌落鉴定方法如氧化酶试验）、氧化酶试验方法（操作步骤、阳性判断）、结果判断（平板生长且氧化酶阳性需鉴定，无生长或鉴定阴性或氧化酶阴性判未检出）等所有步骤、条件和判断标准完全一致。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
金黄色葡萄球菌检查： 对比结果显示，供试液制备和增菌培养（引用1105、取样量、增菌培养基、培养条件）、选择和分离培养（划线培养基、培养条件）、结果判断（特定菌落特征需鉴定，无特征或鉴定阴性判未检出）等所有步骤、条件和判断标准完全一致。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
梭菌检查： 对比结果显示，供试液制备和热处理（引用1105、取样量、热处理条件）、增菌、选择和分离培养（热处理和未热处理供试液接种增菌培养基、厌氧培养、涂抹接种哥伦比亚琼脂、厌氧培养）、过氧化氢酶试验（操作步骤、阳性判断）、结果判断（厌氧杆菌生长且过氧化氢酶阴性需鉴定，无生长或鉴定阴性或过氧化氢酶阳性判未检出）等所有步骤、条件和判断标准完全一致。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
白色念珠菌检查： 对比结果显示，供试液制备和增菌培养（引用1105、取样量、增菌培养基、培养条件）、选择和分离培养（划线培养基、培养条件、典型菌落特征、鉴定方法如显色培养基）、结果判断（疑似菌生长且显色培养基阳性需鉴定，无生长或鉴定阴性或显色培养基阴性判未检出）等所有步骤、条件和判断标准完全一致。分析判断： 本部分内容一致，无实质性变化。
稀释液： 对比结果显示，两个版本关于稀释液的总则（配制后验证灭菌）一致。列出的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、pH6.8/7.2/7.6无菌磷酸盐缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液的制备方法和引用通则一致，允许加入表面活性剂/中和剂的规定也一致。分析判断： 除了稀释液列表的呈现方式调整（新增列出部分成分）外，允许使用的稀释液种类和制备方法没有改变，无实质性变化。
培养基及其制备方法： 对比结果显示，两个版本关于培养基的总则（按处方制备或使用脱水培养基，配制后验证灭菌）一致。列出的所有培养基（TSB, TSA, SDB, SDA, PDA, 玫瑰红钠琼脂, 硫乙醇酸盐流体培养基, 肠道菌增菌液体培养基, 紫红胆盐葡萄糖琼脂, 麦康凯液体培养基, 麦康凯琼脂, RV沙门菌增菌液体培养基, 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂, 三糖铁琼脂, 溴化十六烷基三甲铵琼脂, 梭菌增菌培养基, 哥伦比亚琼脂, 念珠菌显色培养基）的名称、处方组成、各成分含量、详细制备方法、灭菌条件和注意事项等描述完全一致。
差异分析
溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基在灭菌后25℃的pH值要求从7.4±0.2调整为7.2±0.2。念珠菌显色培养基在加热后25℃的pH值要求从6.3±0.2调整为5.9±0.2。pH值是培养基最重要的理化性质之一，它直接影响酶活性、营养物质的溶解度、选择性抑制剂的作用效果以及微生物的生长代谢。对于溴化十六烷基三甲铵琼脂这种用于筛选和鉴别铜绿假单胞菌的选择性培养基，pH值的微小变化可能影响其选择性和促生长性。而显色培养基通过特定的显色底物在微生物酶的作用下产生颜色反应，从而实现快速鉴别。pH值的变化会直接影响酶的活性和显色反应的效率及特异性，进而可能影响白色念珠菌或其他念珠菌属微生物的显色特征和鉴别准确性。因此该变化属于实质性变化，将直接影响培养基的质量控制标准。
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