质控框架：

抗体药物需围绕大小、电荷、糖异质性、活性、含量、残留杂质及翻译后修饰等关键质量属性，建立全流程、系统化质控方法体系。

大小异质性：

SEC 与 CE‑SDS 可检测单抗分子大小变异体，在批次放行和稳定性研究中，二者联合使用，以实现对单抗产品纯度、聚体及片段含量的全面监测。

电荷异质性：

离子交换色谱（IEC）与毛细管 / 成像毛细管等电聚焦电泳（cIEF/icIEF）是抗体电荷异质性分析的核心技术，二者的分离原理、技术特性及应用定位存在显著差异。

糖基化质控：

HILIC‑FLD为抗体 N‑糖基化检测主流方法，需严格控制酶切效率、衍生反应与样品纯化，确保糖谱定量准确、重现性好。

活性测定：

活性分为结合活性与生物学活性；报告基因法、转基因细胞法可精准评估功能活性，适用于放行及稳定性常规检测。

蛋白含量：

主流采用A280 紫外分光光度法，微量/高浓度样品分别用荧光法/SoloVPE 法，方法开发需严格遵循ICHQ2（R2）分析方法验证指导原则与药典相关要求进行。

肽图分析：

用于一级结构确证与批间一致性比对，可灵敏检出序列变异、降解及修饰差异，是质量标准中关键的鉴别项。

工艺残留：

宿主 DNA、HCP、Protein A为工艺相关必控杂质；qPCR、ELISA、LC‑MS/MS等为法定定量方法，保障产品安全性。

翻译后修饰：

传统采用RP‑HPLC、HIC监控关键位点修饰；MAM（多属性监测）技术可实现多修饰位点同步定性定量，显著提升质控效率。

摘要

本文围绕抗体药物质量标准中的质控项目，系统综述了当前的分析技术与研究进展，涵盖大小异质性、电荷异质性、糖异质性、生物学活性（结合/功能活性测定，以及报告基因法等技术方法）、辅料含量、蛋白含量、肽图分析及宿主残留杂质检测等质量属性，详细阐述了相应技术的检测原理、方法开发要点及适用场景。同时，介绍了翻译后修饰表征中多属性监测技术（MAM）的技术优势、开发要点与应用进展。本文梳理的抗体药物质控方法体系与技术进展，可为抗体药物的质量标准建立、质控方法优化、稳定性研究等提供参考，助力抗体药物研发生产的质量控制与监管水平提升。

关键词

单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）的药物类型主要包括单靶点抗体、双/多功能抗体及抗体偶联药物（antibody-drug conjugate，ADC）等，凭借靶向性强、特异性高、疗效确切等显著优势，已成为生物药领域的主要产品类别之一。自1986年首个鼠源单抗药物获批上市以来，抗体药物的研发与制备技术持续迭代升级，分子形式从鼠源、嵌合型逐步发展为人源化、全人源抗体，并逐步拓展至人工智能辅助设计的新型抗体分子。截至2025年底，美国FDA已累计批准153款抗体药物；我国自2000年批准首个进口抗体药物利妥昔单抗以来，已批准90个进口抗体药物和103个国产抗体药物，其中92%于2017年之后获批，适应证覆盖肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、神经系统疾病、感染性疾病及罕见病等多个领域。2025年全球抗体新药市场规模已达3040亿美元，较2024年增长13%；其中有5款抗体药物年销售额超过100亿美元，另有10款抗体药物年销售额介于50亿~100亿美元^[1]。

单抗药物结构复杂、异质性强，制备过程复杂，涉及细胞培养和纯化等多个环节，其关键质量属性（critical quality attribute，CQA）易受培养条件、纯化工艺、储存运输等因素影响；因此需要建立包括工艺参数和规程控制、物料控制、过程控制、放行和稳定性检测、工艺表征和验证等整合的控制策略来确保产品的CQA在适当的限度、范围或分布内，其中质量标准是重要的组成部分。质量标准包括检测项目、分析方法和验收标准（如数值限度、范围或试验的其他标准）。原液、成品或生产阶段的其他材料都应建立一套与其使用目的相符合的标准^[2]。

质量标准用以确保原液和制剂质量，并不代表原液和制剂的全部特征。质量标准通常包含鉴别、纯度和杂质、效价、含量、关键辅料含量、微生物限度/无菌、外观检测。但CQA并不意味着一定要纳入质量标准中，如果特定CQA未包含在质量标准中，应评估其是否需要独立控制。另外应了解产品的稳定性概况，依据产品的特点确定哪些项目适用于稳定性试验，并建立稳定性标准，以确保可检出产品的质量变化。质量标准应将CQA控制在适当的限度、范围或分布内，以确保达到所需的产品质量（ICHQ8）^[3]。通常设定上市申请的可接收限度需要考虑如下因素：从用于临床前和/或临床研究的批次中获得的数据、证明工艺一致性的批次数据、放行和稳定性研究的数Chinese据、产品开发相关的数据、分析方法性能相关的数据、平台知识和先验知识（例如发表的文献）以及法规要求和药典标准等。

分析技术方法作为检测项目的具体实现载体，同时与验收标准的制定存在直接关联，本综述将主要介绍在原液和成品的质量标准中，采用的检测方法的机理、方法开发时的注意事项以及方法的研究进展。注射剂通用检测方法如外观、复溶时间、pH、渗透压、装量/装量差异、不溶性微粒检查、可见异物检查、水分、无菌、细菌内毒素以及异常毒性检查等，虽然通常包含在质量标准中，但本文重点讨论单抗产品质量标准中相对专属的分析方法。

1.1大小异质性

分子大小异质性作为单抗的CQA之一，直接影响单抗产品的安全性和有效性，例如高分子量聚合物通常具有更强的免疫原性，易诱发机体产生抗药抗体；而在生产或储存过程中，因降解或断裂产生的低分子量片段，可能会降低药物与靶点及FcRn受体的结合能力，进而导致药效降低和半衰期缩短，因此必须对单抗的分子大小异质性进行质量控制。2025年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）通则3127收载了2种检测单抗分子大小变异体的方法，分别是十二烷基硫酸钠毛细管电泳（capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate，CE-SDS）和分子排阻色谱（size exclusion chromatography，SEC）。其中，SEC用于评估天然状态下单抗的分子大小分布，对聚体具有良好的分离度，而CE-SDS则适用于变性条件下单抗分子量的异质性分析，凭借其更高的分离效率，更有效地对片段进行分离^[4]。由于单一的检测方法难以全面评估单抗的分子大小异质性，因此在批次放行和稳定性研究中，常将CE-SDS与SEC联合使用，以实现对单抗产品纯度、聚体及片段含量的全面监测。

SEC的分离原理是基于分子大小的不同，其色谱柱内填充的亲水硅胶颗粒，如同一个分子筛，尺寸较大的分子因无法进入颗粒内部的孔道，会被流动相最先洗脱出来，而尺寸较小的分子则会进入孔道，流经路径更长，保留时间更长。最终，样品按照分子尺寸由大到小的顺序被依次洗脱。单抗产品的SEC方法开发可参考《中国药典》通则方法，根据具体产品特性进行细微优化，主要优化方向包括：通过调整流动相组成及流速等参数，提高理论塔板数和分离度，降低拖尾因子，同时降低蛋白与色谱柱的疏水性相互作用。

CE-SDS原理是在高压电场作用下，根据样品组分迁移速率的差异实现分离。在样品处理时加入SDS，与蛋白质结合后，不仅作为变性剂使蛋白质解折叠，更凭借其携带的大量负电荷掩盖蛋白质自身的电荷差异，使蛋白质在电场中的迁移主要取决于其分子尺寸的大小^[5]。在单抗产品CE-SDS方法开发时同样可参考药典通则，需要注意的是，对于非还原CE-SDS，缓冲液组分尤其是pH，是影响测定结果的关键参数，过高的pH（如pH 9.0）环境下，巯基与二硫键交换反应比烷基化试剂对巯基的封闭反应更容易，从而导致热处理过程中产生更多的碎片，而在酸性条件下（pH 5.5~6.5），热诱导产生的片段显著减少^[6]。因此，在非还原CE-SDS方法开发中，应对缓冲液的pH进行优化与控制，以避免方法导致的片段峰升高现象。对于特殊品种，用药典方法检测可能会出现非真实的聚体或者片段，导致杂质含量异常增高，因此，需对检测条件进行优化，例如通过调整缓冲液成分（如添加十六烷基硫酸钠）^[7-8]或更换检测器（如采用灵敏度更高的激光诱导荧光检测器替代传统UV检测器）等方式。由于CE-SDS是在变性及还原条件下检测，对于一些复杂结构的单抗产品，例如半胱氨酸偶联ADC、不对称双抗等，在CE-SDS图谱上展现出与单抗不同的峰形特征^[9]，说明了CE-SDS不仅能够对纯度进行检测，还能成为一种有效的结构确证补充手段。

1.2电荷异质性

1.2.1 离子交换色谱　

1.2.2 毛细管等电聚焦电泳与成像毛细管等电聚焦电泳　

毛细管等电聚焦电泳（capillary isoelectric focusing，cIEF）和成像毛细管等电聚焦电泳（imaged capillary isoelectric focusing，icIEF）凭借高分辨率、高灵敏度及样品用量少的显著优势，已成为抗体药物电荷异质性与等电点（pI）测定的重要技术，广泛应用于单克隆抗体、双特异性抗体及ADC等产品的研发、生产及质控放行全过程[17-20]。cIEF与icIEF技术均以等电聚焦（IEF）为核心原理，其本质是利用蛋白质作为两性电解质在不同pH环境中带电性质的差异，在高压电场作用下，蛋白质分子会沿着pH梯度迁移，最终聚焦于自身等电点（pI）对应的pH区域，形成清晰、锐利的区带，进而实现不同电荷异质性组分的高效分离。这一过程的重点在于pH梯度的精准构建，通常通过两性电解质在毛细管内的分布实现，两性电解质会在电场作用下形成连续、稳定的pH梯度，为蛋白质的聚焦分离提供基础，这也是2种技术实现高分辨率分离的关键前提。二者的核心差异集中于检测方式，这一差异也决定了它们在检测效率、操作便捷性上的不同：cIEF法在完成聚焦过程后，需要通过电压驱动的方式，将毛细管内聚焦形成的区带缓慢流经紫外检测窗口，通过检测不同组分的吸收信号，完成各电荷异质性组分的定性与定量分析，该方法检测结果精准，但流程相对烦琐，检测周期较长；icIEF法则采用全柱成像检测技术，无需进行区带迁移，通过专用成像检测器可实时捕捉整个毛细管内的区带分布情况，快速完成pI测定与各组分含量计算，大幅提升检测效率，且检测结果直观，可直接观察区带的分布与完整性，同时具备更高的自动化程度，更适配高通量检测需求。在方法开发过程中，需围绕分辨率、重复性与准确度三大核心目标，重点关注五大关键要点，即两性电解质组合优化、稳定剂优化、样品（脱盐/酶切）预处理、仪器参数调试，以及系统适用性的设计与验证，确保检测方法的可靠性与适用性。最新研究进展主要集中于毛细管与质谱串联联用、毛细管制备电荷变异体组分等应用拓展方向：cIEF/icIEF与质谱串联可实现“分离-鉴定”一体化，能够快速明确电荷变异体的修饰位点，有效解决传统cIEF/icIEF仅能实现分离定量、无法解析组分结构的局限；icIEF用于电荷变异体组分收集时，可获得高纯度目标组分，为后续组分结构表征、活性分析及生产工艺优化提供有力支撑，助力抗体药物质量控制的合规性提升^[19，21-24]。

cIEF/icIEF与IEC均为抗体电荷变异体分析的核心技术，二者虽目标一致，但分离原理、技术特性及应用定位存在显著差异。IEC基于抗体表面电荷与固定相的静电相互作用强度实现分离，通过梯度洗脱使不同电荷特性的变异体按吸附-解吸差异依次流出。该技术虽存在方法开发流程相对烦琐（需针对性优化固定相、洗脱梯度及缓冲液体系等关键参数）、单针分析时间较长（通常30~60min）的局限，但具备不可替代的制备级分离能力，可通过色谱柱放大实现毫克级电荷变异体的高效收集，为后续变异体的活性验证、结构表征及生产工艺优化提供足量样品支撑，在抗体药物研发的工艺优化阶段发挥关键作用。而cIEF/icIEF以抗体净电荷差异为核心分离依据，基于等电聚焦原理使抗体在pH梯度中迁移至自身等电点（pI）并聚焦，凭借高分辨率及pI直接测定能力的技术优势，更易建立平台化分析方法，无需针对不同抗体逐一优化核心参数，方法通用性强、开发效率高。

1.3 糖异质性

抗体药物的糖型异质性主要源于IgG型单抗Fc区Asn297位点的N-糖基化修饰差异，核心糖型包括岩藻糖化、半乳糖化、唾液酸化、高甘露糖型等，其与抗体药物的稳定性、ADCC/CDC效应、药代动力学及免疫原性密切相关^[25-28]。需基于糖型对药物安全有效性的影响程度进行风险分级，结合产品作用机制、临床数据制定个性化可接受标准。目前针对抗体药物的糖基化检测的主流方法为亲水相互作用色谱-荧光检测法^[29]572（HILIC-FLD），其原理是通过PNGase F酶特异性酶切释放N-糖链，经2-AB、RapiFluor-MS等荧光试剂对糖链还原端进行衍生标记^[30]，然后基于亲水性质差异在HILIC色谱柱上实现分离，通过荧光检测器进行检测，以对照品保留时间定性，峰面积归一化法计算各糖型相对百分含量。尽管此方法被广泛应用于抗体药物的放行检测，但在方法开发时仍需关注以下几点。（1）酶切效率控制：需优化PNGase F的酶用量、样品变性条件、反应温度及反应时间等关键参数，避免因酶切不完全导致定量偏差；需特别注意，少数抗体的Fab端也可存在糖基化位点，需先经过变性、还原处理，才能实现糖链的完全酶切^[31]；（2）衍生效率优化：采用荧光标记时，可选择2-AB、RapiFluor-MS、ProA、InstantPC等多种荧光标记物，应按照不同荧光标记物的特点合理调整衍生试剂比例及反应条件，确保糖链衍生完全；此外还应当根据不同标记物选择合适的检测波长，以达到最佳响应；（3）样品纯化：标记前后糖链需通过蛋白变性、固相萃取、凝胶过滤或者磁珠等方法去除蛋白、盐类尤其是游离的衍生试剂等杂质，防止杂质影响图谱峰形。

此外，还可通过以下方法进行抗体药物的糖基化检测。（1）毛细管电泳-激光诱导荧光检测法（CELIF）：对酶切释放的糖链进行荧光标记，基于毛细管电泳实现糖型分离，利用激光诱导荧光检测器定量^[32]。（2）质谱表征方法（LC-MS）：基于液相色谱高分辨质谱联用（LC-HRMS）技术^[33]，可实现抗体药物在完整蛋白、亚基、糖肽及游离糖链4个层面的全面分析，以呈现糖基化修饰的整体特征，但一般在抗体表征中应用。

1.4 活性

单抗的活性测定，根据其评价方法可分为结合活性与生物学活性。二者的区别在于：单抗与靶抗原结合后是否产生生物学效应，以及是否对该效应进行检测。在单抗的质量控制中，通常建议同时对2种活性进行检测，尤其是生物学活性质量标准限度较宽时。选择单抗生物学活性方法的核心原则是依据其作用机制，另外活性方法的研发也应该根据其研发阶段以及技术实现，并参考相应的技术指导原则。

符合预期的生物学活性方法，首先应符合药物作用机制，其次，应经过翔实科学的方法学验证，数据的考量还应设置合适的系统适用性并制定合理的限度要求。

1.4.1 结合活性

抗原与抗体结合活性的分析，通常建立于药物研发早期。单抗的结合活性目前常见的评价方法主要为酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、流式细胞术，此外还有一些检测单抗结合活性的新技术新方法，如表面等离子体共振法、均相时间分辨荧光、Alpha技术等^[34-35]。

1.4.2 生物学活性

单抗的生物学活性是指其产生预期生物学效应的能力，直接反映单抗药物在临床应用中的体内效力。根据单抗结构将生物学活性划分为2类，基于Fab段和基于Fc段的生物学活性。基于Fab段的单抗生物学活性是由于单抗的Fab段能与抗原特异性结合，从而抑制抗原分子的原有活性。例如：靶向肿瘤抗原的单抗可与肿瘤细胞表面过度表达的抗原结合，从而抑制肿瘤生长；以细胞因子为靶点的单抗可以与细胞因子结合，从而抑制细胞因子与其受体的结合，阻断信号通路向下传导，使该细胞因子作用受到抑制，达到治疗作用。基于Fc段的生物学活性是由于单抗Fc可与效应细胞或补体特异性结合，进而激活效应细胞功能或补体活化。例如：单抗通过Fc段结合杀伤性效应细胞上的Fc受体，同时通过Fab段结合靶细胞，将效应细胞与靶细胞桥联，激活杀伤性效应细胞，介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）和抗体依赖的细胞吞噬作用，导致靶细胞被杀伤或吞噬；此外，单抗Fc段还可结合补体C1q并激活补体级联反应，诱导补体依赖的细胞毒性作用（complement-dependent cytotoxicity，CDC），在肿瘤细胞膜上形成类似穿孔素效应的膜攻击复合物，造成胞外离子大量内流，最终导致肿瘤细胞裂解^[36]。

近年来，基于报告基因的生物学活性检测方法逐渐被开发。报告基因方法可将目标基因质粒和报告基因质粒转染入细胞中，从而构建转基因测活细胞。该细胞可特异性识别靶细胞上的靶抗原表位，激活作用机制通路启动报告基因的表达，并可检测化学发光信号。转基因细胞法具有的操作简单、实验周期短、变异小等优势，更能满足药物批间一致性和稳定性的测定以及监管的需要，也为很多缺乏药物反应性细胞系或易检的细胞学效应的生物技术药物活性测定提供了选择^[37-38]。

应采用合适的数学模型对检测结果进行曲线拟合和数据分析，计算单抗的相对结合活性和生物学活性。常用曲线拟合模型包括：四参数逻辑模型（4PL）、五参数逻辑模型（5PL）、平行线模型（包括平行直线法和平行曲线法）^[29]778。还应对拟合后的曲线进行系统适用性设置，如平行性要求（上/下渐近线比值、斜率比等）、曲线拟合和度要求（决定系数R²）等。

1.5 辅料

1.5.1 聚山梨酯20/80/泊洛沙姆188

聚山梨酯20/80和泊洛沙姆188均为非离子型表面活性剂，是抗体药物中最常用的关键辅料，可防止蛋白聚集及蛋白与容器表面的吸附。截至2025年，在添加了非离子型表面活性剂且已上市的抗体药物中，聚山梨酯80占比约为60%，聚山梨酯20占比约为30%，其余为泊洛沙姆188^[39]，聚山梨酯的添加量多数在0.004%~0.2%（w/v）^[40]范围内。2025年版《中国药典》三部3203聚山梨酯80测定法收载2种方法，第一法为比色法，聚山梨酯80或20分子中的聚乙氧基与硫氰钴铵形成蓝色复合物，溶于二氯甲烷，通过紫外-可见分光光度法进行检测，泊洛沙姆188的测定也可参照此方法^{[29]590，[41]}；第二法为荧光胶束法，聚山梨酯80或20在溶液中形成胶束，结合N-苯基-1-萘胺后荧光显著增强，通过高效液相色谱-荧光检测器检测其含量^[42]；此外，基于这3类表面活性剂不挥发的特性，可使用高效液相色谱-蒸发光散射检测器（high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector，HPLC-ELSD）法或高效液相色谱-电喷雾检测器（high performance liquid chromatography-charged aerosol detector，HPLC-CAD）法进行含量检测^[43-45]。聚山梨酯的含量测定方法还有水解法，可通过水解生成游离脂肪酸，通过高效液相色谱法检测脂肪酸含量来计算其含量^[46]，也可对水解后的脂肪酸进行衍生化生成挥发性化合物，使用气相色谱法测定其含量^[47]。

需要注意的是，聚山梨酯是复杂的酯类混合物，不同来源聚山梨酯各组分含量有差异^[48]，为防止因聚山梨酯来源不同导致的偏差，进行方法开发或含量控制时需选用工艺同源的或经过验证的标准品。此外，聚山梨酯在宿主细胞蛋白残留存在下容易发生降解^[40]。比色法前处理复杂，对降解不敏感，高效液相色谱-荧光胶束法、蒸发光散射检测器法、电喷雾检测器法前处理简单且分别对其不同组分的降解敏感；比如荧光胶束法对多酯组分敏感，蒸发光散射检测器法和电喷雾检测器法对单酯和多酯组分敏感^[49]，当聚山梨酯存在降解风险时，需优先开发对降解敏感的方法。

1.5.2 其他辅料　

辅料是指在生物制品配制过程中所使用的辅助材料，辅料选用是否得当关系到药物的毒副作用、药效发挥及生物利用度^[50]，单抗药物制备过程中的常用辅料包括糖醇类和氨基酸类，其中海藻糖、蔗糖、山梨醇和甘露醇作为抗体药物中常用的保护剂、赋形剂和助溶剂，2025年版《中国药典》四部收载的海藻糖、甘露醇和山梨醇检测方法中，均采用了高效液相色谱-示差折光检测法^[51]，这也是单抗药物中蔗糖含量检测常用的方法。此外，抗体药物中海藻糖、蔗糖、山梨醇和甘露醇含量的检测也可采用HPLC-CAD^[52-54]。氨基酸类辅料多作为助溶剂、缓冲剂[^55]、抗氧剂和稳定剂^[56]，抗体类药物中常见的氨基酸类辅料有组氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸和精氨酸，这几种氨基酸因不含生色基团，无法采用常规的紫外检测器直接检测，多通过衍生剂将氨基酸转化为具有较强紫外或荧光吸收的衍生物^[57-58]才能被检测到。此外，这几种氨基酸的检测也可直接采用反相色谱法进行检测，近年来氨基酸类辅料也陆续开始采用HPLC-CAD法和HPLC-ELSD法进行检测。

近年来，皮下给药因便捷性、患者依从性高等优势，已成为生物给药方式的重要发展方向。透明质酸酶作为皮下制剂的核心辅助成分，其活性稳定性是保障药物递送效率、降低不良反应的关键。目前实验研究中常使用的重组人透明质酸酶（rHuPH20）活性检测方法是浊度法^[59]和紫外分光光度法^[60]。而抗体类药物中透明质酸酶的测定多采用浊度法，原理是透明质酸（HA）可与酸化血清结合形成沉淀，在HA与rHuPH20反应后，通过添加酸化血清来沉淀未被消化的HA。在640nm下测定浊度，即得透明质酸酶活性。

1.6 蛋白质含量

蛋白质含量是抗体药物的核心CQA，是贯穿药物研发、生产、成品放行与全生命周期稳定性考察的核心质控指标，其检测结果直接决定给药剂量准确性、生物学活性与临床用药安全性，也是抗体类生物制品成品放行的必检项目。抗体药物蛋白质含量检测目前用的最多的是2025年版《中国药典》^[29]489中收录的通则0401紫外-分光光度法（A280法），其定量的基础是抗体分子中色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸残基在280nm紫外波长下的光吸收，通过测定蛋白质的消光系数，再通过朗伯-比尔定律进行定量检测。该方法无需复杂前处理、无外源试剂干扰、检测无损。但是紫外分光光度法也有其弊端，它无法进行低于0.2mg·mL^-1蛋白质含量的检测，以及需要高倍数稀释才能进行高浓度抗体药物的检测，因此，微量抗体药物的含量检测可利用蛋白质的荧光特性通过HPLC-荧光检测器实现检测^[61]，而高浓度抗体药物普遍采用重量稀释法来精密测定，或直接采用斜率光谱法（SoloVPE法）^[62-63]进行检测。

无论采用何种方法进行抗体类药物的蛋白质含量检测，其方法的开发需严格遵循ICHQ2（R2）分析方法验证指导原则与药典相关要求^[64]进行。此外，近年来发展起来的复方抗体药物^[65]的检测采用分子排阻色谱、反相色谱等色谱技术实现不同组分抗体药物浓度的准确测定。

1.7 肽图

肽图分析是治疗性抗体结构表征与质量控制体系中的关键技术，主要用于确认蛋白一级结构正确性与产品批间一致性。其原理是通过蛋白酶对抗体进行位点特异性酶切，将大分子蛋白分解为特征性肽段，再经反相色谱分析得到指纹图谱。检测前需对样品进行变性、还原与烷基化处理，使抗体空间结构舒展、二硫键打开并稳定封闭，以保证酶切充分均一。将实测图谱与参比品图谱比对，可有效验证氨基酸序列正确性，并灵敏识别点突变、降解、氧化、脱酰胺及糖基化等结构变化，评价抗体结构完整性与批次间稳定性^[29]629。方法的开发与优化直接决定数据可靠性，其中样品前处理、酶解条件与色谱参数均需系统优化，以保证序列覆盖率与分离效果；胰蛋白酶因酶切位点专一、结果稳定，是较为常用的酶，近年来赖氨酸蛋白酶在抗体肽图分析中的应用也日益增多。此外，还需考察分离度、重现性、肽段覆盖率等系统适用性指标，确保方法满足抗体药物常规质量控制的检测要求。

在抗体药物质量标准中，肽图主要作为鉴别项。通常以特征峰相对保留时间和/或相对峰面积作为一致性判定核心指标，要求供试品肽图与参比品图谱主要特征肽峰全部匹配，无额外异常峰、缺失峰及显著峰面积偏差；同时结合序列覆盖率等指标进行综合判定，确保批间一致性与结构稳定性^[66]。

随着分析技术的不断迭代，抗体肽图分析正朝着高灵敏、高通量、自动化方向快速发展。近年来，基于质谱的多属性表征技术快速发展，可在单次进样中同步完成肽图分析、修饰鉴定与序列确认，为抗体药物全流程质量控制提供更加高效、全面的解决方案^[67]。

1.8 工艺相关杂质残留

1.8.1 宿主DNA（HCD）残留量分析　

HCD可能携带成瘤、致癌基因等风险元件，若残留量过高，可能引发人体细胞的基因突变、成瘤/致癌风险或免疫反应，严格控制HCD残留量。因此，严格控制并将抗体制品的HCD残留量确保其在安全范围内，可降低这些潜在风险，保障患者用药安全^[68]。同时，通过检测HCD残留量可反馈生产工艺对HCD的去除效果，提高产品的纯度和质量，确保产品符合质量标准及监管要求^[69]。

目前各国药典收载的HCD残留量检测方法主要包括定量PCR（qPCR）法、DNA探针杂交法、荧光染色法及DNA结合蛋白法（阈值法）^{[29]632，[70]}。其中，qPCR法因采用宿主细胞特异性引物/探针进行靶向扩增，具有特异性强、灵敏度高、定量准确、线性范围宽等优势，是美国、欧洲、中国及日本等主流药典共同推荐的首选方法，适用于痕量DNA的精准定量。

1.8.2 宿主蛋白（HCP）残留量分析

HCP可能具有免疫原性，残留在药物中可能引发患者的免疫反应，导致过敏、炎症等不良反应，影响药物的安全性和有效性^[71-72]。此外，HCP残留宿主蛋白中的脂酶/脂肪酶活性可能引起聚山梨酯降解，从而影响药物的稳定性并最终干扰药物的预期生物活性[71]。同时，通过检测HCP残留量，可及时发现生产与纯化工艺中的问题，优化工艺流程，提高药物质量和保障产品批间一致性。

目前HCP残留量检测方法主要包括ELISA和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法，其中ELISA是各国药典推荐的法定定量方法，以广谱识别HCP的多克隆抗体为核心，具有灵敏度高、操作相对简便、适合高通量定量与产品放行的优势，是当前质控放行的金标准，但存在仅能测定总HCP含量、无法鉴定具体杂质种类、对低丰度或低免疫原性HCP易漏检的局限，此外，ELISA的覆盖率问题是必须重点考虑的核心关键，其直接决定了ELISA结果的准确性和可靠性，是评估ELISA法适用性的核心指标^[73]。LC-MS/MS作为新兴的表征技术，可实现HCP的定性鉴定与定量分析，能够明确杂质种类、丰度及来源，为工艺去除能力评估和风险评估提供关键信息，弥补了ELISA无法表征具体组分的不足，但存在前处理复杂、检测周期长、难以实现痕量准确定量、不适用于常规放行检测的缺点；二者在实际应用中互为补充，ELISA用于常规定量放行，LC-MS/MS用于研发阶段深度表征与风险杂质溯源以及工艺变更时的可比性研究。

1.8.3 蛋白质A（Protein A）残留量分析

Protein A是一种源自金黄色葡萄球菌的蛋白，其核心作用是通过特异性结合单克隆抗体的Fc段（抗体的恒定区），实现对抗体的高效纯化。纯化后残留的Protein A可能激活人体免疫系统，引发免疫反应，长期或大量暴露可能导致过敏、炎症或其他免疫相关不良反应等；可能与单抗药物的Fc段结合，干扰药物与靶点的结合或影响药物的药代动力学特性，降低药物的疗效。

ELISA是目前应用最广泛的Protein A检测方法^[74-75]，基于抗原-抗体特异性结合原理，通过Protein A捕获抗体结合标准品/供试品后，再加入酶标二抗，最后经底物显色测定吸收度，将供试品吸收度代入Protein A标准曲线中计算供试品Protein A含量。该方法灵敏度高、操作标准化、试剂盒成熟、结果重复性好且可实现高通量检测。检测过程中，实现Protein A与抗体Fc段的有效分离是保证结果准确的前提，常用分离方案主要有3种：酸解离法通过酸性缓冲液破坏二者之间的非共价相互作用，实现快速分离；加热变性法利用高温改变抗体构象，削弱Fc段与Protein A的结合力；化学变性法则借助变性剂破坏蛋白空间结构，从而彻底解除二者结合，为后续残留检测排除干扰^[76]。

目前市面上Protein A填料众多，其结构略有不同，所以在检测不同厂家的Protein A填料时，建议使用与填料一致的Protein A蛋白或者具有代表性的同类Protein A蛋白建立标准曲线再进行定量检测。

1.9 翻译后修饰

在治疗性抗体药物的质量控制体系中，翻译后修饰（PTM）若发生于抗体互补决定区（CDR）或Fc段功能相关区域，可能影响抗原结合活性、Fc效应功能、药代动力学行为及安全性，则此类位点的PTM可被界定为CQA，应考虑纳入工艺控制与放行检验项目，实施定量与限度控制^[4]。在常规质量控制（QC）环节，针对上述关键区域PTM的表征与定量，行业普遍采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）、疏水作用色谱（HIC-HPLC）等经典色谱方法：RP-HPLC基于抗体分子经特异性蛋白酶切后产生的native/修饰肽段在反相色谱柱中保留时间有所差异进行分离，从而对脱酰胺、氧化、异构化等PTM修饰产生的变异体进行精确定量分析；HIC-HPLC对修饰引起的蛋白表面疏水性细微变化更为敏感，适用于Fc区段/亚基或完整抗体水平的PTM相关异质性监控，二者具备方法成熟、耐用性好、定量准确、易于验证等优势，是抗体药物研发与生产中监控CDR与Fc区PTM的主流传统质控手段。但传统单一属性质控方法，存在方法难以开发、操作繁琐、流程耗时及获取的质控数据有限等局限性^[4，77]，而基于高分辨率质谱的多属性方法核心原理是通过将肽图谱与靶向和非靶向分析相结合，通过一次检测准确识别产品异构体、翻译后修饰和序列变异体，同步实现抗体多质量属性的定性定量分析，从而减少对多种正交测试的依赖，已成为同时评估抗体药物中多个CQA的革命性平台，大大减少了与试剂、耗材和仪器维护相关的运营费用，同时明显加快了基本QC测定的周转时间，显著提升质控效率与全面性^[78-84]。MAM的基本流程为抗体经特异性蛋白酶酶解为肽段，经HPLC/UPLC分离后进入HRMS，通过一、二级质谱测定肽段分子量与序列，结合靶向、非靶向检测，同步监测CQAs与未知杂质，无需多种传统单一质控方法，大幅缩短检测周期^[85-86]。许多大型生物制药公司和监管机构已经启动并研究了MAM在QC环境中的应用，突显了其日益普及和有效性^[15，87]。MAM方法开发需围绕产品适用性（完整蛋白/亚基/肽段等）、场景适用性（表征分析/QC放行/稳定性研究等）与法规合规性等开展，重点关注5点：一是标准化样品前处理，优化流程，减少样品制备过程引入的干扰；二是调试色谱与质谱参数，确保肽段分离度与低丰度肽段检测灵敏度；三是按规范完成方法学验证，证明MAM在灵敏度、特异性、准确性和稳健性方面可与离子交换色谱或毛细管电泳等传统正交测定相匹配或超越，保障定量与杂质筛查的可靠性；四是优化数据处理，建立肽段库，实现自动化分析；五是选用合适的对照品控制系统适用性，同时定期校准仪器。最新进展集中在4个方面：一是高灵敏度与高通量升级，新型HRMS与UPLC联用，提升微量杂质检测能力与检测效率；二是数据处理智能化，AI与机器学习实现自动化解析与杂质识别；三是应用场景拓展，覆盖单抗、双抗、ADC、融合蛋白等新型抗体；四是方法标准化，各国监管机构认可其应用，相关标准与对照品逐步完善。MAM未来可广泛应用于抗体全生命周期质控：研发阶段用于候选抗体筛选与工艺优化；生产阶段用于中间控制与放行检测，监控工艺波动；上市后用于稳定性研究与批次一致性评价，同时支撑生物类似药与原研药的质量比对。MAM有望打破传统PTM质控方法的局限性，向高灵敏、高通量、智能化发展，成为抗体药物未来质控的核心手段之一。

抗体药物的质量源于设计（QbD）是贯穿其研发、生产全生命周期的核心理念，从分子设计、工艺开发到质量标准制定，均以预设的CQA为核心目标，通过对工艺参数、物料属性、生产过程的系统性设计与调控，从源头保障产品质量的可控性、一致性与临床价值。而后续的各类质量检测技术与方法，并非独立于设计之外的环节，而是检验产品是否契合设计目标、验证工艺设计有效性的核心手段，是连接设计理念与实际产品质量的关键桥梁。科学的分析方法开发与质量标准制订，是抗体药物质量源于设计理念落地的核心支撑，更是保障单抗产品从研发到上市全生命周期质量可控、临床安全有效的关键基石，二者相互依托、缺一不可，直接决定了单抗产品质量目标的落地成效与监管合规性^[88]。

从分析方法开发来看，作为质量检测的核心载体，其科学性、准确性与适用性是精准表征单抗CQA的前提。单抗药物存在分子量大、结构复杂、异质性强的固有特点^[89]，大小异质性、电荷异质性、糖异质性等CQA的检测，既需要适配不同属性的专属分析技术，也要求方法开发过程中充分考量产品特性，同时严格遵循ICHQ2（R2）^[64]完成方法学验证，确保方法的特异性、精密度、准确度与耐用性。唯有科学开发的分析方法，才能真实、精准反映产品的实际质量状态，为生产阶段的批次放行、稳定性研究提供客观判定依据，更能在工艺变更、产地转移时，实现质量属性的有效比对，保障产品批间一致性。

在生物医药产业国际化的背景下，科学的分析方法开发与质量标准制订，更是单抗产品接轨国际监管标准、实现全球市场准入的关键^[90]。符合ICH等国际规范的分析方法与质量标准，能有效减少产品在国际申报中的技术壁垒，提升产品的国际认可度，助力我国单抗产业从“跟跑”向“领跑”迈进，推动产业高质量发展。

综上，科学的分析方法开发与质量标准制订，是单抗产品质量控制体系的核心组成，是QbD理念落地的关键抓手，更是保障产品安全有效、批间一致、监管合规的根本所在。唯有将二者深度融合于单抗产品全生命周期研发生产中，才能构建系统、完善、适配的质量控制体系，为单抗药物的临床应用与产业发展筑牢质量根基。