目  录

一、指导原则概述与背景

二、总体考虑与核心原则

三、原料药药学研究解读

    （一）物料控制

    （二）生产工艺

    （三）特性鉴定

    （四）质量研究与控制

    （五）对照品与稳定性

四、制剂药学研究解读

    （一）产品开发

    （二）生产工艺

    （三）质量研究与控制

    （四）稳定性

五、药学可比性研究

六、杂质界定策略深度解析

七、关键要点总结与实务建议

八、参考文献与延伸阅读

一、指导原则概述与背景

（一）制定背景

化学合成寡核苷酸药物是近年来备受关注的研发热点领域。该类药物通过化学合成方法制备，具有特定序列和功能，通常由十几个至几十个或更长的核苷酸构成。制备工艺包括固相合成、液相合成以及酶催化片段连接合成等。

由于寡核苷酸药物结构特殊，ICH等国际通用技术指南并未完全将其纳入适用范围。为推动寡核苷酸药物行业发展，助力该类药物的开发与评价，国家药品监督管理局药品审评中心特制定本指导原则。

（二）适用范围

本指导原则适用于以下化学合成寡核苷酸创新药物的上市申请：

·反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotide，ASO）

·小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）

·核酸适配体（Aptamer）

不适用范围：

·mRNA等生物合成的核酸药物

·抗体偶联核酸药物

对于寡核苷酸药物的临床试验申请及仿制药申请，可参考本指导原则相关内容。

（三）寡核苷酸药物的技术特点

寡核苷酸药物通常通过化学修饰技术和/或递送系统提高其体内稳定性或靶向性：

二、总体考虑与核心原则

（一）研发基本原则

寡核苷酸药物的研发应遵循常规小分子化学药物开发的基本原则，重点结合该类产品的结构和工艺特点，进行针对性的研究和控制。可参考ICH Q8、Q9、Q10、Q11等指导原则，运用质量风险管理理念。

（二）质量控制策略

相比于小分子化学药物，寡核苷酸药物具有以下特点，导致仅通过终产品质量标准难以完全控制产品质量：

·结构复杂

·杂质种类多且结构与终产品类似

·精制纯化以及分析手段有限

因此，指导原则建议建立"全过程质量控制策略"：

·对合成的起始原料（如核苷亚磷酰胺等）开展充分研究和控制

·对中间产品（如单链寡核苷酸等）开展充分研究和控制

·结合后续工艺参数控制、杂质清除转化研究

·终产品质量控制

（三）差异化研发策略

寡核苷酸药物类型众多，应针对不同类型产品制定针对性研发策略：

（四）平台经验与先验知识

基于寡核苷酸基本组成单元的结构相似性和生产工艺（如固相合成）的平台技术成熟性，寡核苷酸药物的生产、质量控制及稳定性方面的先验知识和平台经验对该类产品的开发具有一定的借鉴意义，可用于：

·产品的风险评估

·不同临床阶段药学控制

·可比性研究

（五）变更管理原则

寡核苷酸类产品质量可能受原料药起始原料、生产工艺、生产设备、批量、制剂处方工艺等影响。开展关键临床试验后，建议尽量避免不必要的药学重大变更。建议商业化生产拟定的原料药生产工艺、制剂处方工艺等与代表性批次（如关键临床试验批）尽量保持一致。

（六）沟通交流建议

考虑到寡核苷酸药物开发难度相对较大，并且新技术、新方法的应用带来新的挑战，鼓励注册申请人针对化学合成寡核苷酸药物开发中的重要技术问题尽早与药品监管部门进行沟通和交流。

三、原料药药学研究解读

（一）物料控制

1. 起始原料

应参考ICH Q11及其相关问答合理指定起始原料，并全面论述选择合理性。常见的起始原料包括：

·核苷亚磷酰胺（含预加载核苷酸的固相载体）

·非核苷酸部分

重要提示：应尽量避免使用人或动物源的物料作为起始原料，如必须使用时，应说明传染性海绵状脑病（TSE/BSE）的安全性。

1.1 核苷亚磷酰胺

根据寡核苷酸药物的基本组成单元，通常选择受保护的核苷亚磷酰胺作为起始原料。

质量控制要点：

·应与供应商接洽，充分了解起始原料的生产工艺和相关控制信息

·开展起始原料的杂质研究

·结合各类杂质在后续化学反应中的传递、转化和清除情况，评估杂质对终产品质量的影响

起始原料质量控制项目通常包括：

·性状、鉴别、含量、杂质、纯度、水分和残留溶剂等

重点关注：起始原料中部分杂质（如可参与寡核苷酸链反应循环的杂质）通常会在最终的原料药中持续存在，且下游处理和纯化步骤通常无法完全去除，因此应对此类杂质重点关注并在起始原料的质量标准中进行充分控制。

预加载一个核苷酸的固相载体可作为一个整体被指定为起始原料，应结合负载前游离核苷酸、固相载体的质控信息，建立合理的质控策略。

1.2 非核苷酸起始原料

用于寡核苷酸的偶联或衍生的非核苷酸部分，如N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）、聚乙二醇（PEG）、脂肪酸等，如证明合理亦可以作为起始原料。

质量控制项目：

·性状、鉴别、水分、残留溶剂、含量、杂质和纯度等

·建议对可参与后续反应的杂质进行风险评估和研究，制定相应的杂质限度

特别说明：部分创新的非核苷酸起始原料（如新型GalNAc产品）并非市售化学品，一般具有结构复杂、合成步骤多、质控难度大等特点，其引入的杂质与核苷酸偶联的风险较高，因此不宜作为起始原料进行控制，建议进一步考虑前延生产工艺。

2. 其他物料

寡核苷酸生产所使用的其他物料，包括固相载体、溶剂和色谱填料等，应根据其在生产过程中的作用及对终产品质量的影响，制定合理的质量控制策略。

固相载体质量控制：

（二）生产工艺

1. 合成工艺

1.1 固相合成工艺

寡核苷酸通常采用固相合成工艺制备，通过自动合成仪在功能化固相载体上进行。

典型工艺过程：

·以固相载体上相应基团（羟基或预连接第一个核苷酸的羟基）为起始

·以脱保护、偶联、氧化/硫代、封端（如适用）等3～4个步骤为一个循环

·经多次循环，将核苷亚磷酰胺单体沿3'至5'方向逐一连接成寡核苷酸链

·通过脱保护反应（如氨解反应）将寡核苷酸链与固相载体裂解并脱除保护基团

·进一步纯化得到单链寡核苷酸

工艺描述要求：应对单个循环的每个步骤进行详细描述，包括起始原料、试剂、溶剂、反应时间、温度、当量和浓度等。

特殊工艺要求：

·双链寡核苷酸：涉及两条单链寡核苷酸退火步骤，应对退火条件进行详细描述（缓冲液组成、时间、温度等）

·偶联或衍生修饰寡核苷酸：偶联的分子可以在固相合成前、固相合成完成后、纯化后引入，应研究确定偶联步骤的详细工艺

纯化工艺要求：

·明确组分收集、组分合并策略

·建立纯化步骤中过程控制标准

·如涉及副馏分的纯化，需制定相应的纯化策略

·根据GMP相关要求，采取适当措施防止交叉污染

·色谱柱性能（有效塔板数、分离度、堵塞情况等）需符合要求

原料药形式：现阶段，原料药以固体（冻干粉）形式存在是常见的可接受做法。建议慎重开发溶液形式存在的原料药用于制剂生产，如确需选择，请提前与监管机构进行沟通确认。

1.2 其他生产工艺

采用其他寡核苷酸制备技术，如液相合成、酶催化片段连接合成等工艺时，需高度关注额外引入的风险（如偶联效率下降、酶反应引入不同类型杂质等），制定充分的控制策略。

2. 关键步骤和中间产品

应根据ICH Q9～11进行生产工艺的开发，合理界定关键工艺步骤及工艺参数、明确过程控制和中间产品控制。

关键步骤可能包括：

·脱保护、偶联、氧化/硫化、封端

·裂解、分离纯化、浓缩、干燥

·退火（如适用）和冻干（如适用）

中间产品可能包括：

·裂解后粗品、浓缩液

·偶联前的寡核苷酸、退火前的单链寡核苷酸

·冻干前的样品等

中间产品控制要求：需合理制定中间产品内控标准，如鉴别、含量、纯度/杂质等质控指标，应建立合理的分析方法并对分析方法进行必要的验证。建议对中间产品的贮藏条件和暂存时限进行研究，贮藏条件和暂存时限应有稳定性数据支持。

3. 工艺验证

寡核苷酸的工艺验证流程遵循一般化学合成药物的工艺验证原则。注意对于重复使用的物料（如制备色谱柱）应进行适当的验证。建议采用商业生产规模进行工艺验证。

4. 生产工艺开发

通过工艺风险评估和工艺特性研究，明确工艺参数对产品质量的影响，制定相应的控制措施。在论证合理的情况下，可参考相近产品（如寡核苷酸修饰、寡核苷酸链长度等相似的产品）的先验知识。

（三）特性鉴定

1. 结构确证

应通过多种技术手段对寡核苷酸结构和基本特性进行全面表征，包括对一级和/或高级结构的确认。

常用技术手段：

·质谱（MS）

·核磁共振波谱（NMR）

·紫外光谱（UV）

·红外光谱（IR）

·圆二色谱（CD）

一级结构确证

一级结构应重点确认核苷酸序列，包括明确碱基、核糖和骨架的组成及核苷酸的连接位点、反离子等。

高级结构确证

寡核苷酸的高级结构一般包括二级结构（如可能存在的双螺旋结构）和三级结构（如适配体的空间结构）。

立体化学研究

需关注寡核苷酸的立体化学，包括核苷亚磷酰胺起始原料的立体化学纯度，以及在寡核苷酸合成过程中潜在的异构化倾向。

硫代磷酸二酯键的特殊性：对于具有硫代磷酸二酯键的寡核苷酸，由于键合的磷原子是手性的，在偶联反应中会产生2n个非对映异构体的混合物（n为硫代磷酸酯键的数目），需要评估非对映异构体的分布及其重现性，同时关注立体化学对生物/药理活性的影响。

立体化学检测常用方法：31P-NMR、阴离子交换色谱（AEX-HPLC）、离子对反相色谱（IP-RP-HPLC）、CD等。

偶联结构原料药：部分具有偶联结构的原料药，如完整原料药结构确证困难，可对偶联和非偶联部分分别进行结构表征，确定偶联和非偶联部分的结构，并证明偶联位点的专属性。

双链寡核苷酸：对于siRNA等双链寡核苷酸，应分别对单链（正义链、反义链）以及双链进行特性鉴定。

2. 理化性质

理化性质研究包括但不限于：

·性状、含水量、酸碱度

·摩尔吸光系数

·在不同介质中的溶解度

·吸湿性、等电点、固体形态

·热力学性质（TGA、DSC）

特别关注：双链寡核苷酸、适配体应关注Tm值。

（四）质量研究与控制

1. 质量标准

可参照ICH Q6A的基本原则，根据寡核苷酸的结构特点、制备工艺、理化性质合理设定质量研究项目。

原料药质量研究和控制的典型项目：

·性状、鉴别、酸碱度

·纯度和杂质、反离子含量

·水分、细菌内毒素、微生物限度

·含量

其他评估要求：

·应对残留溶剂、元素杂质进行风险评估，制定合理的控制策略

·建议参考国内外相关技术要求开展致突变杂质（包括亚硝胺杂质）的风险评估和研究，必要时在质量标准中进行控制

特殊产品质量标准要求：

·双链寡核苷酸：通常还应包含针对双链特征的鉴别项，如非变性HPLC、Tm等。建议同时使用非变性方法（以测量单链残留量）和变性方法测试纯度

·适配体等具有高级结构的寡核苷酸：通常需进行生物活性测试

2. 分析方法

2.1 分析方法开发

对于水分、细菌内毒素和微生物限度等常规检测项目，应参考国内外药典的分析方法进行测定。针对寡核苷酸的结构和理化特性的特殊检测项目应建立特定的分析方法。

鉴别方法：

·分子量鉴别：实测分子量应与理论分子量一致。通常采用LC-MS、高分辨质谱等方法

·序列鉴别：核苷酸序列应与理论序列一致。可采用质谱进行碎片序列和/或失败序列分析、紫外熔解曲线分析测定Tm（如适用）等

·保留时间鉴别：采用HPLC法对比供试品溶液与对照品溶液主峰保留时间

·反离子、特殊寡核苷酸修饰（如2'F取代）鉴别

双链寡核苷酸鉴别：应分别证明单链与理论结构保持一致，并证明两条单链结合状态。可考虑采用非变性色谱、Tm检测确定结合状态、通过质谱确定两条单链分子量。

纯度和杂质分析：

由于部分寡核苷酸杂质的结构、性质与主成份较为相似，杂质分离难度较大。建议开发合适的分析方法尽可能实现杂质分离。推荐采用多种不同分离原理的分析方法：

·IP-RP-HPLC（离子对反相色谱）

·IEX-HPLC（离子交换色谱）

·LC-MS

·CE（毛细管电泳）

·SEC（分子排阻色谱）

·HILIC（亲水作用色谱）

建议选择富含杂质的样品进行杂质分析方法的研究和确认，如纯化步骤前的粗品、不同工艺参数/纯化条件制备的样品、强制破坏或影响因素及加速试验样品等。

杂质分组控制：对经充分研究仍无法有效分离的寡核苷酸杂质，可考虑按保留时间等对杂质进行分组控制，此时应充分论证分组的合理性，并尽量确定各分组内杂质的组成。

立体异构体检测：可考虑采用的检测方法包括色谱法（AEX-HPLC、IP-RP-HPLC、HILIC）、离子淌度质谱（IM-MS）、CE、NMR、CD和基于酶裂解反应的检测方法等。如无法实现所有异构体的分离，需评估立体异构体的分布，必要时进行合理控制。

含量测定：应明确规定含量限度及其计算方法。含量可采用UV、HPLC、LC-MS等方法进行测定。建议首选专属性较强的方法（如HPLC法）。冻干的寡核苷酸原料药建议含量以无水物标示。

体外生物活性：

·ASO或siRNA等结构相对简单的寡核苷酸：生物活性通常由其序列结构控制，鼓励开发体外生物活性方法，用于可比性等研究。一般无需将体外生物活性纳入常规放行检测项

·适配体或其他具有三维结构的寡核苷酸：作用机制依靠独特的空间结构、特异性结合靶分子而发挥生物活性，通常需建立细胞试验分析方法和其他生物分析方法进行体外生物学活性测定和控制

2.2 分析方法验证

原料药质量控制的分析方法应按照ICH Q2、Q14及国内外药典等相关指导原则进行方法验证。

验证重点：

·关注分析方法的专属性，提供证明寡核苷酸相关杂质与主峰有效分离的色谱图和相关质谱数据

·加强方法的耐用性考察，充分考虑色谱柱、溶剂及其他色谱条件等的影响

·分析方法的灵敏度应满足检测需要，通常情况下，质谱法检测寡核苷酸相关杂质时，分析方法灵敏度应达到0.1%～0.3%

3. 杂质分析

建议结合起始原料和寡核苷酸的合成工艺、中间产品和目标产物的降解途径及降解产物研究，全面分析和表征寡核苷酸的杂质。

3.1 寡核苷酸相关杂质

寡核苷酸相关杂质来源主要包括：起始原料引入、生产工艺过程中形成、生产或贮藏过程中降解产生。

杂质控制限度：

·报告限：0.2%（部分结构复杂、分子量大的杂质可基于分析方法的定量限适当调整）

·鉴定限：1.0%

·界定限：1.5%

对于超过界定限的杂质，应有界定数据支持。寡核苷酸相关杂质可根据杂质的结构分为四个不同的类别：

特别提示：对于其他可能引起安全性担忧的杂质（如与其他靶点杂交且产生药理作用的杂质），即使其含量未超过1.5%，也建议进行合理的安全性评估。

偶联寡核苷酸药物：需关注功能分子中可偶联杂质（例如GalNAc中脱乙酰基、糖环水解等杂质）与寡核苷酸偶联的风险。

3.2 非寡核苷酸杂质

寡核苷酸常规生产工艺（如固相合成中的多次洗涤、制备纯化、超滤等）通常对小分子杂质具有较高的清除能力，针对合成使用的有机溶剂、试剂以及生产过程中的小分子副产物、残留溶剂、元素杂质、配体、保护基等，可根据其清除能力和实际检测数据等评估其残留风险，并按相关指导原则进行控制。

致突变杂质关注重点：

·起始原料可能引入的亚硝胺杂质

·寡核苷酸在合成过程中使用的脱DMT（4,4'-二甲氧基三苯甲基）试剂、氨解试剂、核苷亚磷酰胺的临时保护基团等发生反应生成的副产物

·涉及偶联工艺时偶联物自身或偶联过程中可能形成的致突变杂质

（五）对照品

一般情况下，需建立寡核苷酸原料药及关键中间产品的对照品。双链寡核苷酸的对照品一般包括正义链、反义链和双链寡核苷酸本身。对于用于单链寡核苷酸鉴别（例如Tm）的互补链寡核苷酸，也应建立对照品。

杂质对照品：对于质量标准中规定的特定杂质建议通过定向合成方法制备代表性杂质对照品，也可通过工艺优化或分离纯化获得，其纯度应满足分析要求。

对照品管理：对照品应明确来源（例如，根据商业工艺合成的批次）、制备和标定信息，及对照品批次的表征方法和结果。寡核苷酸对照品应明确贮藏条件及有效期。

（六）稳定性

稳定性研究应遵循ICH稳定性相关指导原则。结合工艺开发过程中发现的药物不稳定因素，在稳定性考察中重点关注。

稳定性研究重点：

·特别关注降解杂质，例如氧化杂质、脱氨杂质、无碱基杂质（脱嘧啶、脱嘌呤）等

·对于吸湿性粉末，稳定性研究中应考察水分

·关注和考察寡核苷酸是否发生聚集现象

四、制剂药学研究解读

寡核苷酸药物大多具有易被酶解、脂溶性差等特点，口服生物利用度较低，通常以注射途径给药（如皮下注射、静脉注射、鞘内注射等），因此本节内容主要根据注射剂进行阐述。随着技术的发展，寡核苷酸药物亦可能被开发为其他制剂类型。

（一）产品开发

1. 剂型及递送系统

寡核苷酸药物通常开发为普通注射剂，包括注射液、注射用无菌粉末。部分品种基于临床需要，可开发为具有载体递送系统的特殊注射剂，如脂质纳米粒等。

2. 处方工艺开发

2.1 处方开发

在常规制剂开发基础上，结合原辅料相容性研究结果，关注辅料是否会引起寡核苷酸药物杂质谱的变化、非预期高级结构和聚集体的形成及其他对产品质量和安全性的潜在影响。

2.2 生产工艺开发

生产工艺开发时应充分了解影响寡核苷酸药物稳定性的各种因素，如pH值、光照、温度等，在拟定生产工艺中应尽量避免敏感因素的影响并制定合理的控制策略。应参照相关指导原则根据研究数据合理选择灭菌/无菌生产工艺。

2.3 相容性等研究

应按照相关指导原则的要求开展包材相容性、生产组件相容性、包装系统密封性、配伍稳定性等相关研究。

2.4 具有载体递送系统的特殊注射剂

对于脂质纳米粒等具有载体递送系统的注射剂，处方开发应重点关注：

·功能性辅料（包括脂质、非脂质辅料）的来源、理化特性、生产工艺、质量控制、稳定性等

·载体递送系统对活性成份的保护作用、递送效率等的影响

·制剂关键质量属性：粒径分布、形态和结构、表面电位、包封率、杂质残留和稳定性等

工艺开发重点：应重点关注药物包封步骤、纯化步骤和除菌过滤等对制剂关键质量属性的影响。

（二）生产工艺

1. 生产工艺

寡核苷酸药物制剂的生产工艺通常包括配液、除菌过滤、灌封、包装等步骤。应结合工艺开发研究及生产设备放大的实际控制能力，合理设定工艺参数。

特殊制剂要求：对于脂质纳米粒等特殊注射剂，需进一步严格工艺控制，载体递送系统的形成步骤应作为关键步骤，并加强中间产品的质量控制。

2. 工艺验证

商业化生产工艺确定后，建议采用商业化生产工艺及规模在商业化生产场地进行工艺验证。考虑到寡核苷酸产品的工艺复杂性和产品变异性，应结合产品开发及风险评估，合理选择工艺验证参数，制定工艺验证方案，验证批次通常不少于三批。

3. 批量

应注意识别从临床规模放大至商业化规模生产过程中的风险并制定控制策略。由于脂质纳米粒等特殊制剂的复杂性，其生产规模变化导致的生产设备及参数的变化可能产生大量不可预期的风险，建议拟定商业化生产批量与关键临床试验样品的生产批量保持一致。

（三）质量研究与控制

应参照注射剂相关指导原则开展寡核苷酸注射剂质量研究。对于脂质纳米粒等纳米载体递送系统，建议同时参考《纳米药物质量控制研究技术指导原则（试行）》、《脂质体药物质量控制研究技术指导原则》（如适用）等国内外相关指导原则开展研究。

1. 质量标准

可参照ICH Q6A的基本原则制定寡核苷酸制剂的质量标准。

质量研究和控制的典型项目：

·注射剂常规控制项目：性状、鉴别、澄清度与颜色、pH值、降解杂质、渗透压摩尔浓度、可见异物、不溶性微粒、细菌内毒素、无菌、含量等

·注射用无菌粉末：还应包括水分、复溶时间等

特殊制剂质量标准要求：

·脂质纳米粒等特殊制剂：应关注功能性辅料（脂质、非脂质）的鉴别和含量、脂质相关降解产物、纳米相关特性指标（结构形态、粒径及粒径分布、表面性质、包封率、释放度）等研究

·涉及高级结构并影响其生物活性的寡核苷酸药物（如适配体）：应考虑进行高级结构和生物活性等检测

·可能发生聚集/聚合的产品：一般应将相关指标（如聚集体、聚合物、高级结构等）纳入成品质量标准进行控制

2. 分析方法

建议结合制剂处方工艺，参考原料药制定制剂的质控分析方法。如经确认方法适用，部分检测项目可直接采用与原料药相同或相近的分析方法，如鉴别、纯度、杂质、含量、生物活性等。

制剂杂质分析方法：在原料药的杂质分析方法基础上，关注制剂降解杂质、原辅料相互作用杂质的分离检出能力，必要时进行优化。对于制剂中的潜在聚集体杂质，应采用合理的分析方法进行检测，如SEC法。

方法验证：采用非药典方法时，应明确分析方法的测定参数，确保可操作性及重现性。对制剂关键考察项目的分析方法应进行完整的方法学验证。鼓励采用杂质对照品进行降解杂质分析方法验证。

3. 杂质分析

应重点研究制剂工艺相关杂质（包括原料药与辅料和/或内包材的反应产物等）、制剂的降解杂质（包括可能出现的聚集体杂质）。应进行元素杂质、致突变杂质（包括亚硝胺杂质）的评估和控制。

常见降解杂质：

制剂寡核苷酸相关杂质限度：通常可接受的报告限为0.2%（部分结构复杂、分子量大的杂质可基于分析方法的定量限适当调整）、鉴定限为1.0%、界定限为1.5%。

（四）稳定性

稳定性研究应遵循ICH稳定性相关指导原则。稳定性研究项目应考察关键质量属性，特别关注降解杂质，例如氧化杂质、脱氨杂质、无碱基杂质（脱嘧啶、脱嘌呤）等。此外还应关注和考察寡核苷酸是否发生聚集现象。

五、药学可比性研究

寡核苷酸药物的开发遵循创新药研发的一般规律，可能面临各类药学变更的情形，应结合所处的产品开发阶段、变更的性质、先验知识和经验等进行风险评估。根据风险评估的结果决定需要进行的可比性研究内容。

药学可比性研究的目的：在于证明药学变更前后产品的关键质量属性一致。

（一）结构确证

通常，发生可能影响产品结构的生产工艺变更（如起始原料供应商变更、固相合成工艺变更、批量放大等），需对变更前后生产的产品进行结构确证及比较。

特殊产品结构确证：

·双链寡核苷酸：应进行双链杂交状态确证研究，采用的方法包括FTIR、紫外熔解曲线分析（测定Tm）等

·存在高级结构的寡核苷酸：应进行高级结构对比研究，采用的方法包括CD、DSC、SEC、SV-AUC等，必要时还需要测定生物活性进行比较

（二）质量对比研究

通常应对质量标准控制项目和产品其他关键质量属性进行检测，如原料药含量、杂质、反离子等；制剂含量、杂质、异构体、释放度（如有）等。

杂质谱对比：质量对比研究需重点关注产品杂质谱，应充分评估变更对杂质谱可能产生的影响，建议使用不同分离原理的分析方法进行深入的杂质对比研究，检测方法需能够涵盖寡核苷酸的完整杂质谱（必要时可采用补充方法进行额外的杂质检测）。

新增杂质处理：如变更后产品检测到新增寡核苷酸杂质，根据杂质水平：

·对于超鉴定限的杂质需进行杂质结构确证

·对于超过界定限的杂质，可遵循杂质分类原则评估是否需进一步进行安全性评估

立体异构体对比：应比较变更前后产品的立体异构体特征，在立体异构体检测的基础上，建议关注可能影响产品立体化学的物料质量（如核苷亚磷酰胺起始原料、载体固定的寡核苷酸、催化剂和溶剂）、生产工艺（如柱层析色谱条件）参数，以论证变更前后的生产工艺所制备的产品立体异构体分布相似。

（三）稳定性对比研究

一般需进行变更前后产品的稳定性研究。重点关注可能受到变更影响的质量属性。

关联评估：如果原料药的药学变更可能影响到制剂的生产工艺或产品质量，通常需要对原料药及其制剂同时进行评估。当药学评估结果表明变更会对产品的安全性或有效性产生风险时，应进一步评估并考虑开展非临床和临床桥接研究。

六、杂质界定策略深度解析

本指导原则附件提供了杂质界定策略决策树，这是寡核苷酸药物杂质控制的核心工具。以下对杂质界定策略进行深度解析。

（一）杂质分类体系

寡核苷酸相关杂质根据结构特征分为四类，不同类别采用不同的界定策略：

（二）杂质界定决策流程

杂质界定的一般决策流程如下：

·第一步：确定杂质含量是否超过报告限（0.2%），超过则需报告

·第二步：确定杂质含量是否超过鉴定限（1.0%），超过则需进行结构鉴定

·第三步：确定杂质含量是否超过界定限（1.5%），超过则需进行界定

·第四步：根据杂质结构进行分类，确定适用的界定策略

·第五步：对于需要安全性评估的杂质，开展相应的毒理学研究或文献论证

（三）特殊情形处理

1. 可能引起安全性担忧的杂质：对于其他可能引起安全性担忧的杂质（如与其他靶点杂交且产生药理作用的杂质），即使其含量未超过1.5%，也建议进行合理的安全性评估。

2. 偶联寡核苷酸药物杂质：需关注功能分子中可偶联杂质（例如GalNAc中脱乙酰基、糖环水解等杂质）与寡核苷酸偶联的风险。

3. 杂质分组控制：对经充分研究仍无法有效分离的寡核苷酸杂质，可考虑按保留时间等对杂质进行分组控制，此时应充分论证分组的合理性，并尽量确定各分组内杂质的组成。

七、关键要点总结与实务建议

（一）核心监管要求总结

（二）研发实务建议

1. 早期规划建议

·在药物开发早期即建立完整的质量控制策略，避免后期重大变更

·充分利用平台技术和先验知识，提高研发效率

·尽早与监管部门沟通重要技术问题

2. 分析方法开发建议

·建立多种分离原理的分析方法平台（IP-RP-HPLC、IEX-HPLC、CE、SEC等）

·质谱检测灵敏度应达到0.1%～0.3%

·重视分析方法的耐用性考察

·定向合成杂质对照品，支持杂质鉴定和方法验证

3. 杂质控制建议

·从起始原料源头控制杂质，重点关注可参与反应循环的杂质

·建立完整的杂质谱，对主要杂质进行结构表征

·根据杂质分类策略制定合理的杂质限度

·关注致突变杂质（包括亚硝胺杂质）的风险评估

4. 变更管理建议

·关键临床试验后尽量避免不必要的药学重大变更

·商业化生产工艺与关键临床试验批尽量保持一致

·建立完善的可比性研究方案，涵盖结构确证、质量对比、稳定性对比

·LNP等特殊制剂建议商业化批量与临床试验批量保持一致

（三）重点关注事项

·立体化学：硫代磷酸二酯键产生2n个非对映异构体，需评估分布和重现性

·高级结构：适配体等产品的生物活性依赖空间结构，需进行高级结构表征和生物活性测试

·聚集现象：原料药和制剂均需关注是否发生聚集

·降解途径：重点关注氧化、脱氨、无碱基等降解杂质

·偶联工艺：GalNAc等偶联物需关注偶联位点专属性和可偶联杂质风险

八、参考文献与延伸阅读

本指导原则参考了以下国内外相关技术指导原则和文献：

（一）国内指导原则

·《化学药物杂质研究技术指导原则》（2005年）

·《创新药（化学药）临床试验期间药学变更技术指导原则》（2021年）

·《化学药品注射剂与药用玻璃包装容器相容性研究技术指导原则（试行）》（2015年）

·《化学药品注射剂包装系统密封性研究技术指南（试行）》（2020年）

·《化学药品注射剂配伍稳定性药学研究技术指导原则（试行）》（2024年）

·《纳米药物质量控制研究技术指导原则（试行）》（2021年）

·《脂质体药物质量控制研究技术指导原则》（2023年）

（二）国际指导原则

·ICH Q6A: 新原料药和新制剂的质量标准

·ICH Q8(R2): 药物研发

·ICH Q9(R1): 质量风险管理

·ICH Q10: 药品质量体系

·ICH Q11: 原料药的研发和生产

·ICH Q2/Q14: 分析方法验证和开发

·EMA: 寡核苷酸研发和生产指导原则草案（2024年7月）

（三）学术文献

·D Capaldi, A Teasdale, S Henry, et al. Impurities in Oligonucleotide Drug Substances and Drug Products. Nucleic Acid Ther, 2017, 27(6): 309-322.