一、引言

细菌内毒素（Bacterial Endotoxin）是革兰氏阴性菌细胞壁外膜中的脂多糖（LPS）成分，具有强致热性，即使极微量存在也可能引发人体严重的发热反应，甚至导致休克和死亡。因此，细菌内毒素检查法是控制注射剂、植入性医疗器械及生物制品热原风险的关键质量控制方法。

随着《中华人民共和国药典》2025年版的正式实施，细菌内毒素检查法在进一步与国际协调文本（ICH Q4B Annex 14）趋同的同时，也保留了基于中国国情的特色要求。对于药品注册申报企业而言，内毒素检查方法学验证资料的质量直接影响审评进度，相关缺陷也是CDE发补（补充资料要求）中的高频问题。本文将系统梳理药典内毒素检测方法体系，并结合发补实践中的常见问题进行深入分析。

二、中国药典内毒素检查法体系

2.1 法规框架

《中国药典》2025年版中，细菌内毒素检查法主要由两部分构成：

• 通则1143 细菌内毒素检查法：规定了具体的检测方法、操作步骤和结果判定标准。

• 通则9251 细菌内毒素检查法应用指导原则：对检查法的内容及应用做进一步说明，提供技术指导。

2025版药典在细菌内毒素检查法方面进一步与ICH协调文本趋同，在方法描述体例、鲎试剂灵敏度复核要求、部分计算参数等方面进行了修订，同时在内毒素限值计算的人均体重标准、检查用水要求、凝胶法干扰试验及限度试验复试要求等方面保留了中国特色。

2.2 核心概念

内毒素限值（L）：药品、生物制品的细菌内毒素限值一般按公式 L = K/M 计算：

• K：为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量。注射剂K = 5 EU/(kg·h)，放射性药品注射剂K = 2.5 EU/(kg·h)，鞘内用注射剂K = 0.2 EU/(kg·h)。

• M：为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，人均体重按60kg计算。

最大有效稀释倍数（MVD）：MVD = cL/λ，其中c为供试品溶液浓度，λ为鲎试剂标示灵敏度（凝胶法）或标准曲线最低内毒素浓度（光度法）。

三、检测方法详解

《中国药典》通则1143规定的细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度测定法两大类共6种方法，供试品检测时可选用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。

3.1 凝胶法（方法1）

凝胶法是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检验或半定量检验内毒素的方法。

凝胶限度法：定性试验，只能判断供试品中含内毒素的量是小于（阴性）还是大于等于（阳性）某值。保温60分钟±2分钟后观察结果，若管内形成凝胶且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性。

凝胶半定量法：通过将供试品进行一系列稀释，根据在何种浓度出现阳性值，通过计算得到一个大致的浓度值。

特点：操作简便，费用低，周期短；只要排除干扰，几乎所有类型的供试品均可采用此法进行检验。

3.2 光度测定法（方法2）

光度法可定量检测内毒素的含量，包括浊度法和显色基质法，每种又分为终点法和动态法。

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方法类型检测原理特点终点浊度法测量反应最终浊度定量，需标准曲线动态浊度法测量达到阈值浊度所需时间高灵敏度，自动化程度高终点显色法测量最终颜色变化（释放呈色团）定量，对浑浊样品干扰较小动态显色法测量颜色变化速率高灵敏度，可自动化

光度法的检测范围比凝胶法宽，使得有干扰的样品可以有更大的稀释倍数。对于部分使用凝胶法无法排除干扰的样品，可以尝试使用光度法建立细菌内毒素检测方法。

3.3 重组C因子法（补充方法）

2025版药典在9251指导原则中明确了重组C因子法（rFC）作为补充方法。C因子是鲎试剂中对细菌内毒素敏感的蛋白，能够选择性识别内毒素。重组C因子法不存在G因子旁路干扰，具有较高的专属性，适合于含有β-葡聚糖干扰的样品检测。

四、方法学验证的关键要素

建立品种的细菌内毒素检查法时，必须进行系统的方法学验证。一个全面可靠的验证试验应注意以下关键环节：

4.1 鲎试剂灵敏度复核试验

当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行灵敏度复核试验。制备2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每一浓度平行4管，计算反应终点浓度的几何平均值λc。当λc在0.5λ~2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于细菌内毒素检查。

4.2 干扰试验

干扰试验是确定供试品能否使用内毒素检查法的决定因素，目的是检验供试品对细菌内毒素试验是否有抑制或增强作用。

关键要求：

• 应使用两个生产厂家的鲎试剂对至少三批样品进行干扰试验。

• 回收率需在50%~200%范围内方为有效。

• 当鲎试剂、供试品来源、配方、生产工艺改变或试验环境发生变化时，须重新进行干扰试验。

4.3 标准曲线可靠性试验（光度法）

标准曲线相关系数|r|应≥0.980，且标准曲线最低内毒素浓度应≥鲎试剂标示灵敏度。

4.4 供试品溶液的制备

一般应使用细菌内毒素检查用水溶解样品。必要时可调节pH值，供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0~8.0范围内为宜。在水中溶解度低的样品可采取超声波、加热助溶、添加助溶剂等方法。

五、发补中常见的内毒素相关问题

在药品注册审评过程中，内毒素检查相关问题是发补的高频领域。以下结合审评实践，梳理常见问题类型：

5.1 内毒素限值制定不合理

问题表现：

• 未按临床实际用量计算限值，仅参考同类品种或国外药典标准，未考虑中国人与外国人体质差异。

• 在L=K/M公式中，K值与M值定义模糊，数值难以准确计算。

• 随意放宽标准，如将计算值0.3 EU/mg自行改为更宽松的限值，且未说明理由。

• 100ml及以上装量的大输液类制剂，内毒素限值超过0.50 EU/ml。

审评关注点：限值必须有明确的计算依据，联合用药应考虑其他制剂可能引入的细菌内毒素；儿科用药、营养不良用药等应考虑体弱患者人群的耐受差异。

5.2 方法学验证不充分

问题表现：

• 仅使用一个厂家的鲎试剂或一个批号的样品进行干扰试验，代表性不足。药典明确规定应使用两个以上厂家的鲎试剂对至少三个批号的样品进行试验。

• 认为国内或国外已有生产的品种，方法学验证就可以不做，导致仿制药未进行系统的干扰试验。

• 实验次数不足，仅经过一次实验就直接上报结果，或将同一试剂溶液分为三份进行平行试验，缺乏独立重复验证。

• 未考察供试液浓度、pH值的影响，未进行干扰性试验，致使出现假阴性和假阳性结果。

5.3 检验方法表述不清楚

问题表现：

• 质量标准中表述模糊，如"取本品，加细菌内毒素检查用水至少稀释40倍后...每ml中含内毒素的量应小于2.4 EU"，未明确是原液限值还是稀释后限值。

• 未注明细菌内毒素检查用水，而是描述为"加水"或"加灭菌注射用水"。

• 未规定具体药品规格，仅描述为"每瓶含"，忽视了规格差异。

5.4 原料药与制剂限值不一致

问题表现：原料药与制剂的内毒素限值缺乏关联性研究，原料药限值过松可能导致制剂无法达到标准要求。制定原料药的细菌内毒素限值时，应参考其制剂的细菌内毒素限值。

5.5 忽视低内毒素回收率（LER）现象

某些制剂（如含表面活性剂、螯合剂的品种）可能存在内毒素被包裹或掩蔽的现象，导致检测回收率偏低。2025版药典9251指导原则新增了对低内毒素回收率现象的描述，要求申请人关注并评估。

5.6 稳定性考察中缺失内毒素项目

部分申报资料在稳定性考察过程中，未在最后时间点进行细菌内毒素检查，不能对制剂的生物学稳定性有充分把握。

5.7 方法转移与变更管理不足

• 生产工艺、处方、生产场地变更后，未重新进行干扰试验。

• 方法从研发实验室转移至QC实验室时，缺乏系统的方法转移验证资料。

• 进口制剂按国外药典方法开发，未充分评估中国药典方法的适用性。

六、应对策略与建议

6.1 限值制定阶段

1. 严格按临床用量计算：依据药品说明书或权威临床用药资料确定M值，结合给药途径确定K值，按L=K/M计算。

2. 参考国外标准时进行转化：若参考USP、EP等国外药典，需结合中国临床实际用量重新计算，不可直接照搬。

3. 关注特殊人群：儿科、老年、重症患者用药应适当严格限值。

4. 大输液特别关注：100ml及以上装量的大输液，限值一般不得超过0.50 EU/ml。

6.2 方法学验证阶段

1. 严格执行双厂家、三批次要求：使用两个生产厂家的鲎试剂对至少三批样品进行干扰试验，确保方法的代表性和可靠性。

2. 全面考察干扰因素：系统研究pH、浓度、辅料、溶剂等对检测的干扰，建立合理的样品前处理方法。

3. 规范实验记录：避免验证资料照抄药典附录，应详细记录试验关键步骤、原始数据、计算过程，确保可追溯。

4. 关注LER现象：对于脂质体、微球、含表面活性剂等特殊制剂，应进行低内毒素回收率评估。

6.3 申报资料撰写阶段

1. 质量标准表述规范：明确内毒素限值的单位（EU/ml、EU/mg或EU/U）、检测方法、稀释倍数（如适用）。

2. 方法学验证资料完整：包括鲎试剂灵敏度复核、干扰试验、标准曲线可靠性试验（光度法）、样品检测结果等。

3. 稳定性研究纳入内毒素：在长期和加速稳定性试验的最后时间点进行内毒素检查。

4. 变更管理到位：任何可能影响检测结果的变化（处方、工艺、鲎试剂厂家等）均需重新验证并更新申报资料。

6.4 方法选择策略

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情形推荐方法理由常规注射剂，无干扰凝胶限度法操作简便，成本低，结果直观需定量监测，工艺控制动态光度法可定量，利于趋势分析和风险预警凝胶法无法排除干扰光度法（更大稀释倍数）检测范围宽，抗干扰能力强含β-葡聚糖干扰重组C因子法不存在G因子旁路干扰，专属性高争议仲裁凝胶限度法药典规定以凝胶限度试验结果为准

七、结语

细菌内毒素检查法是注射剂安全性控制的核心手段之一。《中国药典》2025年版在保持与国际协调趋势的同时，对内毒素限值制定、方法学验证、干扰排除等方面提出了更为明确和严格的要求。

对于药品注册申报企业而言，内毒素检查方法学验证不应被视为简单的"合规性任务"，而应作为产品质量控制体系的重要组成部分。在研发早期即系统规划内毒素检查方法，充分开展方法学验证，规范撰写申报资料，是避免发补、加速审评进程的关键。同时，随着重组C因子法等新型检测技术的成熟和应用，企业在方法选择上拥有了更多灵活性，但无论采用何种方法，科学验证和完整的数据支持始终是监管审评的核心关注点。

参考文献方向：

• 《中华人民共和国药典》2025年版 四部 通则1143 细菌内毒素检查法

• 《中华人民共和国药典》2025年版 四部 通则9251 细菌内毒素检查法应用指导原则

• ICH Q4B Annex 14 Bacterial Endotoxin Test General Chapter

• 裴宇盛等. 《中华人民共和国药典》（2025年版）细菌内毒素检查法应用指导原则修订解读. 中国药物警戒, 2025, 22(10): 1127-1131.